本文關(guān)鍵詞：PRRSV衣殼蛋白GP5-M腺病毒載體的構(gòu)建及其在山羊乳腺中的表達(dá)研究

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【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的感染對(duì)于豬的免疫系統(tǒng)是一把雙刃劍:一方面PRRSV能夠偏好性的吸附免疫細(xì)胞,正是由于PRRSV特異性的結(jié)合免疫細(xì)胞系,特別是巨噬細(xì)胞,一旦PRRSV廣泛的復(fù)制就會(huì)導(dǎo)致免疫的抑制,導(dǎo)致繼發(fā)感染,由此會(huì)引發(fā)多種傳染病疫苗的免疫失敗。另一方面病毒感染后刺激了機(jī)體的免疫系統(tǒng),產(chǎn)生了免疫力,保護(hù)了動(dòng)物機(jī)體免受二次感染。當(dāng)前PRRSV疫苗不是令人滿意的效果和安全性促使人們不斷努力的去研究新一代疫苗。在PRRS(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的防制中,國內(nèi)外相關(guān)專家的研究報(bào)道均認(rèn)為開發(fā)有效預(yù)防PRRS疫苗的著力點(diǎn)在于核酸疫苗。GP5和M蛋白因其特異的抗原特點(diǎn),成為當(dāng)前研究核酸疫苗的明星蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)利用重組載體表達(dá)融合的GP5和M蛋白能夠產(chǎn)生了比兩者單獨(dú)免疫更好地免疫效果。融合表達(dá)的GP5和M蛋白成為研發(fā)更高效預(yù)防PRRSV疫苗的新方向。當(dāng)前重組腺病毒在運(yùn)送疫苗抗原上成為最高效的載體系統(tǒng)之一。腺病毒載體已被廣泛應(yīng)用于人類基因治療,研制人類和各種動(dòng)物基因工程疫苗。乳腺已被確定為生產(chǎn)真核修飾重組蛋白的有吸引力的選擇。在乳腺上皮細(xì)胞中合成的異源蛋白會(huì)立即分泌到乳汁中,而且這些蛋白可以使用相對(duì)簡單的層析系統(tǒng)進(jìn)行純化。我們利用雙啟動(dòng)子的腺病毒過表達(dá)系統(tǒng)選擇了PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白M與GP5串聯(lián)融合表達(dá),從而更好地發(fā)揮PRRSV M、GP5蛋白的特異抗原活性以及協(xié)同作用,并初步驗(yàn)證其在山羊乳腺上皮細(xì)胞和乳汁中的表達(dá),為PRRSV的基因工程疫苗的研究開辟新的途徑。本實(shí)驗(yàn)的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:(1)成功克隆了1221bp的PRRSV衣殼蛋白GP5和M蛋白融合連接并在N端加有信號(hào)肽、HIS標(biāo)簽的CDS區(qū),構(gòu)建了PRRSV表達(dá)加有信號(hào)肽HIS標(biāo)簽融合表達(dá)的GP5和M蛋白的重組腺病毒載體pBHG-SignalP-His-GP5-M,RT-PCR驗(yàn)證了載體構(gòu)建成功。(2)采用兩步法細(xì)菌內(nèi)同源重組,成功包裝出了腺病毒rHAd-SignalP-His-GP5-M,并擴(kuò)增了該病毒測得其滴度為1011TU/ml。(3)包裝的腺病毒rHAd-SignalP-His-GP5-M成功感染了乳腺上皮細(xì)胞,并利用Q-PCR檢測到病毒感染的乳腺上皮細(xì)胞中有高量的GP5-M基因表達(dá)。Western blotting檢測到乳腺上皮細(xì)胞和細(xì)胞上清中GP5-M蛋白的表達(dá)。(4)山羊乳腺活體灌注包裝的腺病毒rHAd-SignalP-His-GP5-M,利用Western blotting從收集的乳汁中檢測到高量的GP5-M融合蛋白的表達(dá),這為下一部大量病毒抗原的純化收集奠定了基礎(chǔ)
【關(guān)鍵詞】：腺病毒載體 GP5-M蛋白 山羊乳腺表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.651
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 文獻(xiàn)綜述12-28
• 第一章 豬繁殖與呼吸綜合征病毒的研究概況12-21
• 1.1 PRRSV的病原學(xué)及理化學(xué)特性13-15
• 1.1.1 病毒粒子13
• 1.1.2 PRRSV的遺傳多樣性13
• 1.1.3 PRRSV的基因組13-15
• 1.2 PRRS免疫學(xué)研究進(jìn)展15-16
• 1.3 PRRSV疫苗研究概況16-21
• 1.3.1 PRRSV的減毒活疫苗作為候選疫苗的研究16-17
• 1.3.2 重組載體表達(dá)PRRSV的病毒蛋白作為候選疫苗17-19
• 1.3.3 候選的DNA疫苗19-21
• 第二章 重組腺病毒載體疫苗21-24
• 2.1 腺病毒的一般特征21-22
• 2.2 動(dòng)物重組腺病毒的分類22-23
• 2.3 腺病毒載體在防治PRRSV中的一些應(yīng)用23-24
• 第三章 乳腺生物反應(yīng)器24-28
• 3.1 乳腺的特征24-25
• 3.2 乳腺生物反應(yīng)器的研究25-28
• 實(shí)驗(yàn)研究28-57
• 第四章 表達(dá)PRRSV GP5-M蛋白腺病毒的包裝28-45
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料29-32
• 4.1.1 主要耗材、試劑29-30
• 4.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器30-31
• 4.1.3 試驗(yàn)中所用試劑配制31
• 4.1.4 載體和菌株31-32
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法32-40
• 4.2.1 腺病毒載體的選擇32
• 4.2.2 PRRSV GP5和M基因CDS區(qū)的克隆32-35
• 4.2.3 重組腺病毒載體pBHG-SignalP-His-GP5-M的構(gòu)建與鑒定35-39
• 4.2.4 重組腺病毒的包裝與滴度的測定39-40
• 4.3 結(jié)果40-43
• 4.3.1 豬藍(lán)耳病毒衣殼蛋白GP5和M基因CDS區(qū)的克隆與鑒定40
• 4.3.2 重組腺病毒載體pBHG-SignalP-His-GP5-M的構(gòu)建與鑒定40-41
• 4.3.3 重組腺病毒的包裝與滴度的測定41-43
• 4.4 討論43-44
• 4.5 小結(jié)44-45
• 第五章 GP5-M蛋白在山羊乳腺中的表達(dá)研究45-57
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料45-47
• 5.1.1 主要耗材、試劑45-46
• 5.1.2 主要儀器46
• 5.1.3 試驗(yàn)中所用試劑配制46-47
• 5.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物47
• 5.2 試驗(yàn)方法47-50
• 5.2.1 乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)47
• 5.2.2 測定重組腺病毒47-48
• 5.2.3 目的基因GP5-M蛋白在乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)檢測48
• 5.2.4 Western blotting檢測GP5-M蛋白在乳腺上皮細(xì)胞和細(xì)胞上清中的表達(dá) . 375.2.5 腺病毒rHAd-SignalP-His-GP5-M的大量擴(kuò)增、收集和純化48-49
• 5.2.5 腺病毒 r HAd-Signal P-His-GP5-M 的大量擴(kuò)增、收集和純化49-50
• 5.2.6 His-GP5-M蛋白在奶山羊乳腺中的表達(dá)50
• 5.3 結(jié)果50-55
• 5.3.1 乳腺上皮細(xì)胞的分離純化和鑒定50
• 5.3.2 測定重組腺病毒50-52
• 5.3.3 目的基因GP5-M在乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)檢測52
• 5.3.4 Western blotting檢測乳腺上皮細(xì)胞和細(xì)胞上清中GP5-M蛋白的表達(dá)52-53
• 5.3.5 腺病毒的大量擴(kuò)增、純化與滴度測定53-54
• 5.3.6 His-GP5-M蛋白在奶山羊乳腺中的表達(dá)54-55
• 5.4 討論55-56
• 5.5 小結(jié)56-57
• 全文結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-70
• 致謝70-71
• 作者簡介71

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 趙永旺;王子軾;朱達(dá)文;周廣生;管遠(yuǎn)紅;蘇曉健;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒混合感染的調(diào)查[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年03期

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3 蔡錦順;PRRSV GP5與M蛋白重組犬2型腺病毒的構(gòu)建及其免疫特性研究[D];吉林大學(xué);2010年

4 徐彥召;高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒致弱毒株NSP2復(fù)制非必需區(qū)的鑒定及其表達(dá)外源基因的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

5 馬乃祥;豬高效精液稀釋液研究與應(yīng)用效果評(píng)價(jià)[D];海南大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：838672