本文關(guān)鍵詞：視黃醇對(duì)仔豬睪丸支持細(xì)胞體外生物學(xué)特性的影響

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【摘要】：視黃醇及其代謝產(chǎn)物是雄性動(dòng)物睪丸發(fā)育和精子發(fā)生所必需的物質(zhì)。支持細(xì)胞是睪丸內(nèi)視黃醇作用的靶細(xì)胞,為生精細(xì)胞發(fā)育和成熟提供特有的微環(huán)境。本試驗(yàn)以分離自3-5周齡仔豬睪丸的支持細(xì)胞為材料,采用RT-PCR、CCK-8、ELISA檢測(cè)支持細(xì)胞內(nèi)增殖和凋亡相關(guān)基因、細(xì)胞因子的表達(dá),分析視黃醇對(duì)仔豬睪丸支持細(xì)胞增殖、凋亡和表達(dá)細(xì)胞因子的影響,獲得如下結(jié)果：1仔豬支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定經(jīng)比較3組酶消化法所獲得細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活率和GATA-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果顯示,先以0.25%膠原酶IV和0.1%透明質(zhì)酸酶,37°C消化60 min,再以0.25%胰酶和0.1%DNase I,37°C消化20 min,有利于支持細(xì)胞的富集。于貼壁不同時(shí)間收集細(xì)胞,分析懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞中GATA-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果顯示,支持細(xì)胞在2h內(nèi)不貼壁,貼壁時(shí)間主要分布在3-5 h。采用差異貼壁和低滲處理后純化細(xì)胞,形態(tài)不規(guī)則,胞體寬大,細(xì)胞核呈卵圓或不規(guī)則形；GATA4染色呈陽(yáng)性,堿性磷酸酶染色呈陰性；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,純化后細(xì)胞表達(dá)支持細(xì)胞標(biāo)記GATA4、 SOX9、INHB,不表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CYP17、3β-HSD和管周細(xì)胞標(biāo)記α-SMA,符合支持細(xì)胞的驀本特征；經(jīng)ELISA檢測(cè)顯示,本試驗(yàn)所分離支持細(xì)胞表達(dá)GDNF、LIF、 CSF-1、FGF2、EGF,而SCF未檢出。2視黃醇對(duì)支持細(xì)胞增殖和凋亡的影響分別在培養(yǎng)基中添加0.005 μmol/L、0.025 μmol/L、0.125 μmol/L、0.625μmol/L、 1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L視黃醇,短期培養(yǎng)(24 h)和長(zhǎng)期培養(yǎng)(3d)后,經(jīng)CCK-8檢測(cè)支持細(xì)胞活性,結(jié)果如下：培養(yǎng)24h,視黃醇濃度低于5μmol/L,對(duì)支持細(xì)胞的活性沒有顯著影響,而濃度達(dá)到5μmol/L顯著抑制支持細(xì)胞活性,表明5μmol/L及以上濃度的視黃醇對(duì)支持細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性效應(yīng)；培養(yǎng)3d,視黃醇濃度低于為0.005μmol/L和0.025μmol/L時(shí)對(duì)支持細(xì)胞活性無(wú)顯著影響,視黃醇濃度為0.125μmol/L和0.625μmol/L時(shí)顯著抑制支持細(xì)胞活性(P0.05),濃度達(dá)到1.25μmol/L時(shí)表現(xiàn)極顯著抑制(P0.01)。短期培養(yǎng)和長(zhǎng)期培養(yǎng)結(jié)果顯示,視黃醇的作用具有時(shí)效性和劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)選取1.25 μmol/L作為視黃醇的試驗(yàn)濃度,應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)分析視黃醇對(duì)細(xì)胞增殖(PCNA、C-MYC和BCL-2)和凋亡相關(guān)基因(CASP3和BAX)表達(dá)的影響,結(jié)果顯示：視黃醇組增殖相關(guān)基因的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組,凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。結(jié)果表明視黃醇通過(guò)抑制支持細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)基因表達(dá),促進(jìn)凋亡相關(guān)基因表達(dá),進(jìn)而抑制支持細(xì)胞增殖。3視黃醇對(duì)支持細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響在培養(yǎng)基中添加1.25 μmol/L視黃醇,應(yīng)用RT-PCR分析和ELISA檢測(cè)分析視黃醇對(duì)支持細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的影響,RT-PCR分析顯示,視黃醇顯著抑制支持細(xì)胞內(nèi)GDNF、CSF-1和EGF mRNA表達(dá),對(duì)LIF和FGF2 mRNA表達(dá)沒有顯著影響；經(jīng)ELISA檢測(cè),視黃醇顯著抑制支持細(xì)胞中GDNF、LIF、CSF-1、FGF2、EGF蛋白的表達(dá)。綜上所述,視黃醇具有抑制支持細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)基因表達(dá),促進(jìn)凋亡相關(guān)基因表達(dá),和抑制支持細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞因子的作用,進(jìn)而降低支持細(xì)胞活性,抑制支持細(xì)胞增殖。
【關(guān)鍵詞】：豬 睪丸 支持細(xì)胞 視黃醇
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S828
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 縮略詞表9-12
• 第一章 支持細(xì)胞生物學(xué)特性以及應(yīng)用研究和視黃醇對(duì)雄性生殖的影響的研究現(xiàn)狀12-23
• 1 睪丸支持細(xì)胞的生物學(xué)特性和研究現(xiàn)狀12-19
• 1.1 支持細(xì)胞發(fā)育12-13
• 1.2 支持細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)13-14
• 1.3 支持細(xì)胞的功能14-17
• 1.4 支持細(xì)胞的分離鑒定17-18
• 1.5 支持細(xì)胞的應(yīng)用探索18-19
• 2 視黃醇及其代謝產(chǎn)物在雄性生殖中的作用19-22
• 2.1 視黃酸與雄性生殖19-22
• 2.2 視黃醇對(duì)支持細(xì)胞的影響的研究現(xiàn)狀22
• 3 研究的目的意義22-23
• 第二章 仔豬睪丸支持細(xì)胞分離、純化和鑒定23-38
• 1 材料23-24
• 1.1 試驗(yàn)材料23
• 1.2 主要試劑23
• 1.3 主要試劑配制23-24
• 2 方法24-29
• 2.1 分離24-25
• 2.2 支持細(xì)胞貼壁性質(zhì)分析和純化25
• 2.3 鑒定25-26
• 2.4 RT-PCR26-27
• 2.5 支持細(xì)胞的傳代和生長(zhǎng)曲線繪制27-28
• 2.6 ELISA檢測(cè)部分細(xì)胞因子的表達(dá)28
• 2.7 支持細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇28-29
• 2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)29
• 3 結(jié)果29-35
• 3.1 不同消化方法的分離效率比較29-30
• 3.2 支持細(xì)胞貼壁性質(zhì)分析和純化30-31
• 3.3 持細(xì)胞的鑒定31-32
• 3.4 支持細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和生長(zhǎng)去曲線繪制32-34
• 3.5 ELISA檢測(cè)分析細(xì)胞因子的表達(dá)34-35
• 3.6 支持細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇35
• 4 討論35-37
• 5 小結(jié)37-38
• 第三章 視黃醇對(duì)支持睪丸支持細(xì)胞體外生物學(xué)特性的影響38-50
• 1 材料38-39
• 1.1 試驗(yàn)材料38
• 1.2 主要試劑38-39
• 2 方法39-42
• 2.1 視黃醇對(duì)支持細(xì)胞增殖的影響39-41
• 2.2 視黃醇對(duì)支持細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響41
• 2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)41-42
• 3. 結(jié)果42-47
• 3.1 視黃醇作用濃度分析42-43
• 3.2 視黃醇對(duì)支持細(xì)胞增殖的影響43-44
• 3.3 視黃醇對(duì)支持細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的影響44-47
• 4 討論47-48
• 5 小結(jié)48-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-62
• 致謝62-63
• 碩士期間發(fā)表論文63

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