本文關(guān)鍵詞：七鰓鰻PHB2增強細胞氧化應(yīng)激耐受的作用及機制初探

  更多相關(guān)文章： 七鰓鰻 PHB2 氧化應(yīng)激 耐受性增強 機制初探

【摘要】：七鰓鰻是我國東北部特有的魚形動物,是連接無脊椎與脊椎動物的橋梁。PHB蛋白廣泛分布于多種生物細胞中,主要以異源二聚體的形式錨定在線粒體內(nèi)膜,動態(tài)維持線粒體結(jié)構(gòu)及功能的穩(wěn)定。當(dāng)線粒體氧化呼吸鏈功能異常,氧自由基過量積累,極易形成氧化應(yīng)激,它是引起神經(jīng)退行性疾病、腫瘤及諸多慢性病癥的重要原因�；赑HB動態(tài)調(diào)節(jié)線粒體功能穩(wěn)定與細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)緊密相關(guān),PHB正逐步成為研究多種細胞增強氧化應(yīng)激耐受作用的熱點蛋白。然而PHB家族之一的PHB2與處于氧化應(yīng)激環(huán)境中七鰓鰻適應(yīng)性的關(guān)系,目前尚無人研究。本論文以七鰓鰻PHB2蛋白在組織、細胞氧化應(yīng)激中的作用和機制為著眼點開展研究,有助于七鰓鰻PHB2蛋白功能的揭示,為闡述人PHB2在氧化應(yīng)激中作用機制的演化提供了線索。本研究利用免疫熒光實驗檢測了七鰓鰻Lm-PHB2蛋白在鰓和腎細胞中的定位,利用阿霉素注射和H2O2刺激的方法分別構(gòu)建七鰓鰻氧化應(yīng)激動物模型和人正常細胞的氧化應(yīng)激模型,通過QPCR和Western blot的方法檢測了Lm-PHB2在氧化應(yīng)激刺激前后各組織中的分布和表達,通過外加蛋白孵育細胞和構(gòu)建真核表達載體及細胞瞬時轉(zhuǎn)染實驗,利用MTT法分析了重組蛋白rLm-PHB2和真核表達蛋白Lm-PHB2在人張氏肝細胞和肺上皮細胞氧化應(yīng)激中的作用,利用激光共聚焦顯微鏡觀察了氧化應(yīng)激條件下Lm-PHB2在人張氏肝細胞中的定位遷移,利用QPCR法分析了氧化應(yīng)激條件下Lm-PHB2與VDAC3和TP53之間的表達關(guān)系。結(jié)果表明,Lm-PHB2主要定位在線粒體和細胞核;Lm-PHB2在七鰓鰻的主要組織中均有表達,且它的表達與組織細胞的氧化應(yīng)激密切相關(guān);rLm-PHB2能夠增加人張氏肝細胞和肺上皮細胞的氧化應(yīng)激耐受性;Lm-PHB2增強張氏肝細胞氧化應(yīng)激耐受性與其從細胞核向線粒體的定位遷移緊密相關(guān);氧化應(yīng)激條件下Lm-PHB2與VDAC3和TP53在不同組織中表現(xiàn)出不同的表達關(guān)系。綜上,七鰓鰻Lm-PHB2能夠增強細胞的氧化應(yīng)激耐受性,在人張氏肝細胞中很可能是通過蛋白的定位遷移實現(xiàn)的,而在七鰓鰻的組織細胞中可能是利用與VDAC3和TP53的相互作用,通過多條信號通路增強細胞的氧化應(yīng)激耐受性。
【關(guān)鍵詞】：七鰓鰻 PHB2 氧化應(yīng)激 耐受性增強 機制初探
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 第1章 緒論9-18
• 1.1 七鰓鰻研究進展及其特殊地位9-10
• 1.1.1 東北七鰓鰻概況9
• 1.1.2 七鰓鰻研究進展9-10
• 1.1.3 七鰓鰻的研究價值10
• 1.2 PHB研究進展10-15
• 1.2.1 PHB的結(jié)構(gòu)10
• 1.2.2 PHB的定位10-11
• 1.2.3 PHB的功能11-15
• 1.2.3.1 PHB在細胞核中的功能11-13
• 1.2.3.2 PHB在線粒體中的功能13-14
• 1.2.3.3 PHB在氧化應(yīng)激中的作用14-15
• 1.3 氧化應(yīng)激15-17
• 1.3.1 活性氧及氧化應(yīng)激15
• 1.3.2 活性氧的生理功能15-16
• 1.3.3 活性氧對機體的損傷16
• 1.3.4 氧化應(yīng)激的研究意義16-17
• 1.4 本論文的研究目的和意義17-18
• 第2章 phb2在七鰓鰻各組織中的表達18-31
• 2.1 實驗材料與方法18-23
• 2.1.1 實驗材料、試劑與設(shè)備18-19
• 2.1.2 實驗方法19-23
• 2.1.2.1 免疫熒光檢測Lm-PHB2蛋白的亞細胞定位19
• 2.1.2.2 阿霉素免疫東北七鰓鰻及組織分離19
• 2.1.2.3 Total RNA提取19-20
• 2.1.2.4 RNA反轉(zhuǎn)錄20-21
• 2.1.2.5 RT-PCR及QPCR檢測phb2在各組織中的表達21-22
• 2.1.2.6 Western Blot檢測PHB2在各組織中的表達22-23
• 2.2 結(jié)果23-29
• 2.2.1 七鰓鰻Lm-PHB2蛋白的亞細胞定位23-25
• 2.2.2 RNA提取結(jié)果25
• 2.2.3 氧化應(yīng)激模型構(gòu)建25-26
• 2.2.4 phb2在七鰓鰻各組織中mRNA的相對表達量26-28
• 2.2.5 PHB2在七鰓鰻各組織中的蛋白表達量28-29
• 2.3 討論29-30
• 2.4 小結(jié)30-31
• 第3章 rpEGFP-N1-Lm-phb2真核表達載體的構(gòu)建31-42
• 3.1 實驗材料與方法31-37
• 3.1.1 實驗材料、試劑與設(shè)備31-32
• 3.1.2 實驗方法32-37
• 3.1.2.1 七鰓鰻phb2基因引物設(shè)計32
• 3.1.2.2 七鰓鰻phb2基因擴增32-33
• 3.1.2.3 目的片段phb2的回收33-34
• 3.1.2.4 七鰓鰻phb2基因真核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建34-35
• 3.1.2.5 質(zhì)粒提取、鑒定及去內(nèi)毒素35-36
• 3.1.2.6 張氏肝細胞(Chang liver cell,CHL)的培養(yǎng)36
• 3.1.2.7 瞬時轉(zhuǎn)染36-37
• 3.2 實驗結(jié)果37-40
• 3.2.1 七鰓鰻phb2基因擴增37
• 3.2.2 七鰓鰻phb2真核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建37-39
• 3.2.3 重組質(zhì)粒rpEGFP-N1-Lm-phb2的真核轉(zhuǎn)染驗證39-40
• 3.3 討論40-41
• 3.4 小結(jié)41-42
• 第4章 Lm-PHB2增強CHL和L132細胞的氧化應(yīng)激耐受性42-51
• 4.1 實驗材料與方法42-44
• 4.1.1 實驗材料、試劑與設(shè)備42
• 4.1.2 實驗方法42-44
• 4.1.2.1 rLm-PHB2的誘導(dǎo)表達42-43
• 4.1.2.2 rLm-PHB2的純化與定量43
• 4.1.2.3 細胞培養(yǎng)43-44
• 4.1.2.4 MTT細胞增殖實驗44
• 4.1.2.5 細胞轉(zhuǎn)染44
• 4.1.2.6 Western blot實驗44
• 4.2 實驗結(jié)果44-49
• 4.2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達與純化44-45
• 4.2.2 重組蛋白rLm-PHB2增強CHL和L132細胞氧化應(yīng)激耐受性45-48
• 4.2.3 真核表達Lm-PHB2增強CHL細胞氧化應(yīng)激耐受性48-49
• 4.3 討論49-50
• 4.4 小結(jié)50-51
• 第5章 七鰓鰻PHB2增強細胞氧化應(yīng)激耐受作用的機制初探51-59
• 5.1 實驗材料與方法51-53
• 5.1.1 實驗材料、試劑與設(shè)備51
• 5.1.2 實驗方法51-53
• 5.1.2.1 真核表達載體的瞬時轉(zhuǎn)染51
• 5.1.2.2 激光共聚焦顯微鏡熒光檢測51-52
• 5.1.2.3 QPCR檢測phb2、tp53、vdac3在七鰓鰻各組織中的表達52-53
• 5.2 實驗結(jié)果53-57
• 5.2.1 RNA提取結(jié)果53
• 5.2.2 氧化應(yīng)激狀態(tài)下Lm-PHB2蛋白的定位及遷移53-54
• 5.2.3 phb2、tp53、vdac3在免疫后七鰓鰻各組織的分布變化54-57
• 5.3 討論57-58
• 5.4 小結(jié)58-59
• 結(jié)論59-60
• 本文創(chuàng)新點60-61
• 參考文獻61-65
• 附錄65-67
• 附錄1 pEGFP-N1質(zhì)粒圖譜65
• 附錄2 阿霉素誘導(dǎo)七鰓鰻氧化應(yīng)激后提取心臟、肝臟、腎臟、腸、肌肉共計30個組織樣品反轉(zhuǎn)得到的cDNA濃度65-66
• 附錄3 大腸桿菌免疫七鰓鰻后提取心臟、肝臟、腎臟共計18個組織樣品反轉(zhuǎn)得到的cDNA濃度66-67
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況67-68
• 致謝68

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本文編號：783594