本文關(guān)鍵詞：幾種桉樹焦枯病原菌的快速分子檢測技術(shù)研究

  更多相關(guān)文章： 桉樹焦枯病 快速檢測技術(shù) 雙重PCR LAMP 巢式PCR

【摘要】：桉樹(Eucalyptus spp.)是桃金娘科(Myrtaceae)桉樹屬(Eucalyptus)植物的總稱,同時是世界著名的用材林樹種和速生樹種,與楊樹、松樹并稱為林業(yè)上的三大速生造林樹種。桉樹在我國西南、東南、長江中下游等地區(qū)的生態(tài)環(huán)境建設(shè)以及解決生物能源問題中發(fā)揮著不可替代的作用,具有重要的經(jīng)濟、社會、生態(tài)效益。目前在我國西南地區(qū)由半知菌亞門的帚梗柱孢屬真菌(Cylindrocladium scoparium)引起的桉樹焦枯病嚴(yán)重危害著桉樹的林業(yè)生產(chǎn)建設(shè)。由于該病害發(fā)病癥狀極易與其他桉樹葉部病害混淆,傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定存在困難,因此建立能夠在病害發(fā)生早期快速診斷病害的分子生物學(xué)診斷方法迫在眉睫。本研究選定不同的靶基因序列,分別建立了基于ITS與factor 1-alpha序列桉樹焦枯病菌的雙重PCR檢測體系、巢式PCR體系、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系(LAMP)三種分子生物學(xué)診斷技術(shù),以期為桉樹焦枯病的林業(yè)生產(chǎn)建設(shè)提供有力的技術(shù)保障。本研究取得如下結(jié)果：1.成功構(gòu)建了基于ITS與factor 1-alpha序列桉樹焦枯病菌的雙重PCR檢測體系。該體系以桉樹焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium) DNA為模版,分別以ITS和factor 1-alpha序列為靶區(qū)域,針對Cylindrocladium屬和Cylindrocladium scoparium設(shè)計了CYS1/CYS2和EF-S-1/EF-A-1兩對特異性引物,建立了基于屬和種的雙重PCR快速檢測技術(shù)。利用引物BCYS1/CYS2可以將全部Calonectria屬的供試菌株擴增出一條351 bp大小的條帶,單獨用特異性引物EF-S-1/EF-A-1進行PCR擴增僅病原菌擴增出一條197bp大小的條帶,同時使用2對引物時,病原菌可擴增出兩條明亮條帶。當(dāng)體系退火溫度為53℃時,DNA靈敏度檢測限度達到450 fg/μL。野外田間時效檢測結(jié)果顯示,該體系能準(zhǔn)確檢測出不同發(fā)病程度桉樹組織上的病原菌,完全符合田間檢測的要求。2.針對Cylindrocladium scoparium菌株的beta-tubulin gene上保守序列極強的靶基因區(qū)域序列進行特異性引物BT-S-1/BT-A-1和通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A的設(shè)計和合成,分別利用常規(guī)PCR和巢式PCR技術(shù)對引物特異性和靈敏度進行檢測和比較,同時對所建立的巢式PCR用于桉樹焦枯病原菌快速檢測的田間時效性進行驗證。結(jié)果表明,利用beta-tubulin gene序列通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR對全部供試菌株進行擴增,所有參試菌株均可擴增出一條500 bp左右大小的條帶；而單獨使用特異性引物BT-S-1/BT-A-1進行常規(guī)PCR擴增時僅病原菌能夠擴增出一條大小為148 bp的明亮條帶；當(dāng)利用通用引物作為第一輪引物,以稀釋10倍后的第一輪PCR產(chǎn)物作為第二輪PCR模板,利用特異性引物進行巢式PCR擴增時,也可擴增出上述148 bp大小的明亮條帶,且巢式PCR的擴增效果較常規(guī)PCR具有明顯的視覺優(yōu)越性；靈敏度檢測試驗表明,巢式PCR的靈敏度可檢測到4.5 fg/μL,較常規(guī)PCR可以擴增出的極限D(zhuǎn)NA濃度4.5 pg/μL至少提高了103倍；田間時效檢測試驗也說明巢式PCR較常規(guī)PCR具有更高的準(zhǔn)確度和靈敏性,可達到田間檢測的要求。3.建立了桉樹焦枯病快速有效的LAMP'快速檢測技術(shù)。本試驗以桉樹焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium為研究對象,利用Primer Explorer V4.0設(shè)計軟件,針對C. scoparium的beta-tubulin gene特異保守區(qū)域設(shè)計了一套LAMP特異性引物組(內(nèi)引物FIP/BIP,外引物F3/B3,環(huán)引物L(fēng)ooPF/LooPB),優(yōu)化并建立了桉樹焦枯病原菌的LAMP快速檢測體系。研究得到,LAMP反應(yīng)體系為(50 μl):8 U Bst DNA Polymerase 1 μl; 5 M甜菜堿溶液3.0 μl; 2.5mM dNTP 3.5 μl; 10×Thermopol II 2.5 μl; 100 mM MgCl2 μl; 40μM FIP/BIP各1 μl; 10 μM F3/B3各0.5 μl; 10μM LooPF/LooPB各1 μl; DNA模板2μl；用ddH2O補足體積至50μl。反應(yīng)程序為：65℃水浴鍋中反應(yīng)45 min,90℃下滅活5 min結(jié)束反應(yīng)。特異性檢測結(jié)果顯示,供試的22個樣本菌株LAMP產(chǎn)物可以采用肉眼觀察、紫外燈照射、添加熒光染料SYBR GreenI、以及電泳檢測條帶四種不同的形式予以區(qū)分。DNA靈敏度檢測結(jié)果顯示,建立的LAMP體系具有較高檢測靈敏度,可達到45 pg/μL,完全符合田間檢測的要求。野外田間時效檢測結(jié)果顯示,無論是利用紫外檢測還是電泳檢測均可成功的檢測出各地區(qū)不同生理小種的桉樹焦枯病原菌C. scoparium,且檢測效果明顯。該LAMP檢測是-項能夠作為野外基層田間檢測的重要技術(shù)�？傊�,本研究針對桉樹焦枯病病原菌C. scoparium所建立的三種分子生物學(xué)快速檢測技術(shù)均可有效用于桉樹焦枯病害的早期診斷。巢式PCR體系具有高于其他兩種檢測方法的較高靈敏度,檢測極限達到4.5 fg/μL,而普通常規(guī)PCR的檢測極限僅僅為4.5pg/μL；其次基于ITS與factor 1-alpha序列桉樹焦枯病菌的雙重PCR檢測體系,可以檢測到的DNA極限濃度相同,達到450 fg/μL,仍然高于LAMP的DNA極限檢測濃度。LAMP檢測靈敏度雖然較其他二者低,但其可視性觀測結(jié)果使之成為最具生產(chǎn)潛力的檢測手段。
【關(guān)鍵詞】：桉樹焦枯病 快速檢測技術(shù) 雙重PCR LAMP 巢式PCR
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S763.7
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 符號說明9-12
• 前言12-14
• 1 文獻綜述14-21
• 1.1 桉樹焦枯病概述14-17
• 1.1.1 桉樹焦枯病的起源和發(fā)展14
• 1.1.2 桉樹焦枯病的癥狀及危害14-15
• 1.1.3 桉樹焦枯病的病原研究15-16
• 1.1.4 病原菌生物學(xué)特性研究現(xiàn)狀16-17
• 1.1.5 桉樹焦枯病的防治現(xiàn)狀17
• 1.2 植物病原真菌的分子檢測技術(shù)17-18
• 1.3 幾種常見的分子檢測技術(shù)簡介18-21
• 1.3.1 基于核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的常規(guī)PCR和巢式PCR技術(shù)18-19
• 1.3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)19-20
• 1.3.3 其他分子檢測技術(shù)概述20-21
• 1.4 分子檢測技術(shù)的應(yīng)用前景21
• 2 研究目的及意義21-22
• 3 研究內(nèi)容及技術(shù)路線22-24
• 3.1 研究內(nèi)容22-23
• 3.1.1 基于ITS與factor 1-alpha序列桉樹焦枯病菌的雙重PCR快速檢測體系的建立與田間時效性檢測22
• 3.1.2 巢式PCR快速檢測方法的建立與田間時效性檢測22-23
• 3.1.3 一種快速檢測桉樹焦枯病菌(Cylindrocladium scoparium)的LAMP體系的建立與田間時效性檢測23
• 3.2 技術(shù)路線23-24
• 4 研究材料與方法24-35
• 4.1 研究材料24-27
• 4.1.1 供試菌株24-25
• 4.1.2 供試培養(yǎng)基25
• 4.1.3 DNA提取試劑及材料25-27
• 4.1.4 LAMP所需試劑27
• 4.1.5 試驗設(shè)備27
• 4.2 研究方法27-35
• 4.2.1 供試菌株的選擇及菌絲體的培養(yǎng)27
• 4.2.2 供試菌株DNA提取27-28
• 4.2.3 DNA質(zhì)量檢測28
• 4.2.4 供試菌ITS區(qū)PCR及測序檢測28-29
• 4.2.5 基于ITS與factor 1-alpha序列的雙重PCR體系的建立29-31
• 4.2.6 巢式PCR體系的建立31-33
• 4.2.7 LAMP體系的建立33-35
• 5 結(jié)果與分析35-48
• 5.1 供試材料基因組DNA提取結(jié)果35-36
• 5.2 基于ITS與factor 1-alpha序列的雙重PCR體系36-39
• 5.2.1 ITS區(qū)引物的特異性36
• 5.2.2 factor 1-alpha(tefl)區(qū)引物的特異性36-37
• 5.2.3 雙重PCR引物的特異性37
• 5.2.4 雙重PCR靈敏度檢測37-38
• 5.2.5 野外田間時效性檢測38-39
• 5.3 巢式PCR體系分析39-42
• 5.3.1 通用引物PCR擴增結(jié)果39
• 5.3.2 常規(guī)PCR特異性引物BT-S-1/BT-A-1擴增結(jié)果39-40
• 5.3.3 巢式PCR擴增反應(yīng)結(jié)果40
• 5.3.4 常規(guī)PCR與巢式PCR靈敏度檢測40-41
• 5.3.5 巢式PCR野外時效性檢測41-42
• 5.4 LAMP體系分析42-48
• 5.4.1 Cylindrocladium屬真菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建42-43
• 5.4.2 beta-tubulin gene區(qū)通用引物PCR擴增結(jié)果43-44
• 5.4.3 LAMP反應(yīng)體系的建立44
• 5.4.4 特異性反應(yīng)結(jié)果的判斷44-46
• 5.4.5 LAMP反應(yīng)DNA敏感度46
• 5.4.6 LAMP野外田間時效46-48
• 6 結(jié)論與討論48-53
• 6.1 建立桉樹焦枯病菌快速分子檢測的必要性48
• 6.2 基于ITS與factor 1-alpha序列雙重PCR的優(yōu)越性48-49
• 6.2 巢式PCR體系的高靈敏性49-50
• 6.4 LAMP體系的時效性50-51
• 6.5 結(jié)論51-53
• 參考文獻53-60

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本文編號：781087