本文關鍵詞：致病性壞死梭桿菌120ku血凝素相關外膜蛋白基因的克隆及其特性分析

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【摘要】：壞死梭桿菌(Fusobacterium necrophorum)是一種嚴格厭氧的革蘭氏陰性桿菌,具有多形性,常引起人的急性咽炎綜合征(Lemierre's Syndrome)和牛、羊、鹿等動物的腐蹄病、肝膿腫、壞死性皮炎、犢牛白喉。目前還沒有商品化的壞死梭桿菌疫苗,國內(nèi)外主要使用抗生素來治療該病,但是抗生素帶來的負面影響越來越受到人們重視,為了研究120 ku血凝素相關外膜蛋白的生物學特性,并揭示其作為基因工程亞單位疫苗預防壞死桿菌病的可行性,本研究根據(jù)已報道的F.necrophorum 120 ku血凝素相關外膜蛋白基因部分核苷酸序列,克隆出該基因完整的核苷酸序列,生物信息學分析了該蛋白的分子特征,參考抗原表位預測結果,將F.necrophorum 120 ku血凝素相關外膜蛋白基因的開放閱讀框(Open reading frame)分為3個彼此重疊的基因片段p1、p2、p3,進行原核表達,純化的重組蛋白P1、P2、P3分別免疫實驗兔,檢測兔血清中特異性抗體水平,主要研究內(nèi)容如下:1.根據(jù)已報道的F.necrophorum 120 ku血凝素相關外膜蛋白基因部分核苷酸序列(登錄號:AF529887.1),采用染色體步移技術,克隆出該基因完整的核苷酸序列并用高保真酶進行驗證,全長4 247 bp,含有一個3 372 bp的ORF,編碼1 123個氨基酸,蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量約為120 ku。生物信息學分析表明,該蛋白可能是具有血凝活性的外膜自轉運蛋白家族成員,并具有較強的抗原性。2.F.necrophorum 120 ku血凝素相關外膜蛋白的原核表達及純化。參考抗原表位預測結果,將F.necrophorum 120 ku血凝素相關外膜蛋白基因的ORF分為3個彼此重疊60 bp左右的基因片段p1、p2、p3,構建重組表達載體p ET-28a-p1、p ET-32a-p2、p ET-32a-p3,在大腸桿菌中進行誘導表達,利用AKTA purifier蛋白純化系統(tǒng)獲得48 ku、59 ku、62 ku的重組蛋白P1、P2、P3,Western blot分析顯示,純化后的重組蛋白P1、P2、P3具有良好的反應原性。3.將純化的重組蛋白P1、P2、P3分別免疫實驗兔,檢測兔血清中的特異性抗體,結果顯示,兔血清中的抗體效價分別為1:32、1:16、1:16,表明重組蛋白均可誘導實驗兔產(chǎn)生特異性抗體,具有良好的免疫原性。綜上所述,F.necrophorum 120 ku血凝素相關外膜蛋白基因的克隆及其免疫原性的初步分析,為進一步了解120 ku血凝素相關外膜蛋白的生物學功能提供理論基礎,并為基因工程亞單位疫苗和診斷制劑的研制提供了物質(zhì)材料。
【關鍵詞】：壞死梭桿菌 120 ku血凝素相關外膜蛋白 染色體步移 免疫原性分析
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-14
• 英文縮略表14-15
• 第一章 引言15-21
• 1.1 壞死梭桿菌概述15-18
• 1.1.1 壞死梭桿菌病原特征15-16
• 1.1.2 壞死梭桿菌的致病機理16
• 1.1.3 壞死梭桿菌的檢測16-18
• 1.2 未知基因的克隆18-20
• 1.2.1 探針法18
• 1.2.2 接頭法18
• 1.2.3 差減雜交18
• 1.2.4 圖位克隆18-19
• 1.2.5 同源克隆19
• 1.2.6 反向PCR19-20
• 1.2.7 cDNA末端快速擴增20
• 1.3 本研究的目的及意義20-21
• 第二章 致病性壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因的克隆與生物信息學分析21-33
• 2.1 材料與方法21-25
• 2.1.1 菌種、載體和試劑21
• 2.1.2 主要儀器21-22
• 2.1.3 引物設計與合成22
• 2.1.4 FN(AB)基因組DNA的提取22
• 2.1.5 FN(AB)120 ku血凝素相關外膜蛋白基因 5’端旁側序列的克隆與測序22-24
• 2.1.6 FN(AB)120 ku血凝素相關外膜蛋白基因 3’端旁側序列的克隆與測序24
• 2.1.7 FN(AB)120 ku血凝素相關外膜蛋白基因 5’端旁側序列的驗證24
• 2.1.8 FN(AB)120 ku血凝素相關外膜蛋白基因 3’端旁側序列的驗證24
• 2.1.9 FN(AB)120 ku血凝素相關外膜蛋白基因的序列分析24
• 2.1.10 FN(AB)120 ku血凝素相關外膜蛋白的生物信息學分析24-25
• 2.2 結果與分析25-31
• 2.2.1 FN(AB)120 ku血凝素相關外膜蛋白基因 5’端旁側序列的克隆與測序25-26
• 2.2.2 FN(AB)120 ku血凝素相關外膜蛋白基因 3’端旁側序列的克隆與測序26
• 2.2.3 FN(AB)120 ku血凝素相關外膜蛋白基因 5’端旁側序列的驗證26-27
• 2.2.4 FN(AB)120 ku血凝素相關外膜蛋白基因 3’端旁側序列的驗證27
• 2.2.5 FN(AB)120 ku血凝素相關外膜蛋白基因的序列分析27-28
• 2.2.6 FN(AB)120 ku血凝素相關外膜蛋白的生物信息學分析28-31
• 2.3 討論31-33
• 第三章 致病性壞死梭桿菌 120 ku血凝素相關外膜蛋白基因的分段克隆及表達載體的構建33-43
• 3.1 材料與方法33-37
• 3.1.1 菌種與載體33
• 3.1.2 主要試劑33
• 3.1.3 主要儀器33-34
• 3.1.4 引物設計與合成34
• 3.1.5 基因片段p1、p2、p3的PCR擴增34-35
• 3.1.6 基因片段p1、p2、p3 PCR產(chǎn)物的回收35
• 3.1.7 重組克隆質(zhì)粒的構建35
• 3.1.8 重組克隆質(zhì)粒轉化E.coli Trans T135
• 3.1.9 重組克隆質(zhì)粒的提取35
• 3.1.10重組克隆質(zhì)粒的PCR鑒定35
• 3.1.11重組克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定35-36
• 3.1.12重組克隆質(zhì)粒的測序鑒定36
• 3.1.13重組表達質(zhì)粒的構建36
• 3.1.14重組表達質(zhì)粒轉化E.coli Trans T136
• 3.1.15重組表達質(zhì)粒的提取36-37
• 3.1.16重組表達質(zhì)粒的PCR鑒定37
• 3.1.17重組表達質(zhì)粒的雙酶切鑒定37
• 3.1.18重組表達質(zhì)粒的測序鑒定37
• 3.1.19重組表達質(zhì)粒轉化BL21（DE3）plysS37
• 3.1.20重組表達質(zhì)粒的提取與鑒定37
• 3.2 結果與分析37-41
• 3.2.1 基因片段p1、p2、p3的擴增37-38
• 3.2.2 重組克隆質(zhì)粒的PCR鑒定38-39
• 3.2.3 重組克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定39
• 3.2.4 重組克隆質(zhì)粒的測序鑒定39-40
• 3.2.5 重組表達質(zhì)粒的PCR鑒定40
• 3.2.6 重組表達質(zhì)粒的雙酶切鑒定40-41
• 3.2.7 重組表達質(zhì)粒的測序鑒定41
• 3.3 討論41-43
• 第四章 致病性壞死梭桿菌 120 ku血凝素相關外膜蛋白的原核表達及純化43-54
• 4.1 材料與方法43-45
• 4.1.1 主要試劑43
• 4.1.2 主要儀器43
• 4.1.3 重組原核表達質(zhì)粒在大腸桿菌中最適表達條件的篩選43
• 4.1.4 SDS-PAGE分析43-44
• 4.1.5 P1、P2、P3的大量表達44
• 4.1.6 P1、P2、P3的分離純化44-45
• 4.1.7 Western blot分析45
• 4.2 結果與分析45-52
• 4.2.1 重組原核表達質(zhì)粒在大腸桿菌中最適表達條件的摸索45-51
• 4.2.2 純化產(chǎn)物P1、P2、P3的SDS-PAGE分析51-52
• 4.2.3 Western blot分析52
• 4.3 討論52-54
• 第五章 致病性壞死梭桿菌重組 120 ku血凝素相關外膜蛋白的兔體免疫試驗54-56
• 5.1 材料與方法54-55
• 5.1.1 主要試劑及實驗動物54
• 5.1.2 主要儀器54
• 5.1.3 抗原的制備54
• 5.1.4 動物分組及免疫程序54
• 5.1.5 兔血清的抗體檢測54-55
• 5.2 結果與分析55
• 5.2.1 兔血清的抗體檢測55
• 5.3 討論55-56
• 第六章 全文結論56-57
• 參考文獻57-63
• 致謝63-64
• 附錄64-77
• 作者簡歷77

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王宏俊;張培君;龔玉梅;楊漢春;;B型副雞嗜血桿菌血凝素基因的克隆表達及生物活性鑒定[J];畜牧獸醫(yī)學報;2007年01期

2 ;科技動態(tài)[J];中國家禽;2006年24期

3 章銀梅,楊月琴,朱小榮,湯懋z，

本文編號：736637