本文關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)研究

  更多相關(guān)文章： 豬繁殖與呼吸綜合征病毒 IL-10 嵌合病毒 ORF1a nsp2

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的,以仔豬呼吸困難和母豬繁殖障礙為主要特征的一種傳染病。2006年我國(guó)爆發(fā)了由HP-PRRSV引起的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。HP-PRRSV與經(jīng)典PRRSV相比致病性和傳播能力更強(qiáng),引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的炎性反應(yīng)和免疫抑制更嚴(yán)重。作為重要的免疫抑制因子與抗炎因子,IL-10在病毒介導(dǎo)的免疫抑制中起重要作用。多個(gè)研究結(jié)果顯示PRRSV感染引起的對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制與IL-10的表達(dá)水平密切相關(guān)。目前對(duì)PRRSV感染后誘導(dǎo)機(jī)體IL-10表達(dá)水平上調(diào)機(jī)制的研究還不深入,開展PRRSV誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生機(jī)制的研究有利于更深入的了解PRRSV感染產(chǎn)生免疫抑制的基礎(chǔ),為PRRS的防控提供有益的參考。實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示:強(qiáng)毒株HuN4及其傳代致弱病毒HuN4-F112體內(nèi)感染豬后,HuN4株能夠誘發(fā)高水平的IL-10表達(dá),而HuN4-F112感染后IL-10表達(dá)水平則很低。為研究PRRSV強(qiáng)弱毒感染后誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生的分子基礎(chǔ),我們首先對(duì)PRRSV HuN4株強(qiáng)弱毒體外感染PAM細(xì)胞誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生水平進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:HuN4強(qiáng)弱毒感染PAM細(xì)胞后,誘導(dǎo)IL-10表達(dá)水平存在明顯差異,HuN4感染后誘導(dǎo)高水平的IL-10表達(dá),而HuN4-F112感染后IL-10表達(dá)水平很低。對(duì)調(diào)節(jié)IL-10產(chǎn)生的通路研究結(jié)果顯示,HuN4強(qiáng)毒感染PAM細(xì)胞后與弱毒HuN4-F112相比能夠誘導(dǎo)TLR2與TLR4轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),TLR7和TLR9轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),TLR3轉(zhuǎn)錄水平則無(wú)明顯差異。對(duì)TLR下游的重要調(diào)節(jié)因子TRIF和MyD88轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)結(jié)果顯示:強(qiáng)毒感染PAM細(xì)胞后與弱毒HuN4-F112相比TRIF轉(zhuǎn)錄水平得到上調(diào),MyD88轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著。對(duì)ERK與p38研究結(jié)果顯示:強(qiáng)毒HuN4感染PAM細(xì)胞后能夠持續(xù)上調(diào)p38磷酸化表達(dá)水平,而HuN4與HuN4-F112感染PAM細(xì)胞后ERK磷酸化水平無(wú)顯著變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):PRRSV HuN4強(qiáng)弱毒感染PAM細(xì)胞后,誘導(dǎo)IL-10表達(dá)水平存在明顯差異,強(qiáng)毒顯著高于弱毒。強(qiáng)弱毒感染PAM細(xì)胞誘導(dǎo)IL-10表達(dá)水平的差異可能是由于強(qiáng)毒通過(guò)調(diào)控p38 MAPK磷酸化水平造成的。為了探尋PRRSV基因組上對(duì)IL-10表達(dá)具有調(diào)控作用的區(qū)域,我們首先利用實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的嵌合病毒rHuN4-F5-ORF1a、rHuN4-F5-ORF1b、rHuN4-F5-ORF2-7、rHuN4-F112-ORF1a、rHuN4-F112-ORF1b和rHuN4-F112-ORF2-7在體外感染PAM細(xì)胞,結(jié)果顯示PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)ORF1a以及結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)能夠顯著影響IL-10的表達(dá)。利用反向遺傳技術(shù),將病毒nsp1、nsp2、nsp9-10和nsp9-11在強(qiáng)弱毒間進(jìn)行互換,獲得拯救病毒命名為rHuN4-F5-nsp1、rHuN4-F5-nsp2、rHuN4-F5-nsp9-1、rHuN4-F5-nsp9-11、rHuN4-F112-nsp1、rHuN4-F112-nsp2、rHuN4-F112-nsp9-10和rHuN4-F112-nsp9-11。將拯救嵌合病毒體外感染PAM細(xì)胞后,檢測(cè)IL-10表達(dá)情況。結(jié)果顯示:強(qiáng)毒替換弱毒nsp2編碼區(qū)后,嵌合病毒誘導(dǎo)IL-10表達(dá)顯著下降,弱毒替換強(qiáng)毒nsp2編碼區(qū)后,嵌合病毒誘導(dǎo)IL-10表達(dá)水平顯著上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)nsp2可能在病毒體外感染PAM細(xì)胞誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生中起重要作用。
【關(guān)鍵詞】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒 IL-10 嵌合病毒 ORF1a nsp2
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.651
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 英文縮略表11-12
• 第一章 引言12-21
• 1.1 豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）12
• 1.2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）12-15
• 1.2.1 PRRSV的基因組構(gòu)成12-13
• 1.2.2 PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白13-14
• 1.2.3 PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白14
• 1.2.4 PRRSV的基因多樣性14
• 1.2.5 PRRSV的復(fù)制機(jī)制14-15
• 1.3 PRRSV感染與先天性免疫應(yīng)答15-17
• 1.3.1 Toll樣受體信號(hào)15-16
• 1.3.2 PRRSV感染對(duì)先天性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)16-17
• 1.4 IL-10研究進(jìn)展17-20
• 1.4.1 IL-10的生物學(xué)活性及功能17-20
• 1.4.2 PRRSV與IL-1020
• 1.5 研究目的與意義20-21
• 第二章 PRRSV HuN4株強(qiáng)弱毒體外誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生差異的分子基礎(chǔ)研究21-31
• 2.1 材料和方法21-25
• 2.1.1 病毒和細(xì)胞21
• 2.1.2 試劑與儀器21-22
• 2.1.3 豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）的獲取22
• 2.1.4 病毒感染22
• 2.1.5 細(xì)胞總RNA的提取22-23
• 2.1.6 cDNA合成23
• 2.1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR23
• 2.1.8 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)PRRSV病毒含量23-24
• 2.1.9 ELISA檢測(cè)IL-10蛋白24-25
• 2.1.10裂解細(xì)胞和Western blot分析25
• 2.2 結(jié)果25-29
• 2.2.1 PRRSV強(qiáng)弱毒感染PAM細(xì)胞后IL-10的表達(dá)存在明顯差異25-27
• 2.2.2 PRRSV強(qiáng)弱毒感染PAM細(xì)胞復(fù)制水平存在明顯差異27
• 2.2.3 PRRSV強(qiáng)弱毒感染PAM細(xì)胞TLR出現(xiàn)差異表達(dá)27-28
• 2.2.4 PRRSV強(qiáng)弱毒感染PAM細(xì)胞后對(duì)MyD88和TRIF的影響28-29
• 2.2.5 PRRSV強(qiáng)毒感染PAM細(xì)胞后激活p38 MAPK通路29
• 2.3 討論29-31
• 第三章 PRRSV不同編碼區(qū)對(duì)IL-10影響的研究31-43
• 3.1 材料與方法31-35
• 3.1.1 病毒和細(xì)胞31
• 3.1.2 試劑與儀器31
• 3.1.3 嵌合病毒構(gòu)建策略31-33
• 3.1.4 嵌合病毒的拯救33-34
• 3.1.5 拯救嵌合病毒的鑒定34
• 3.1.6 拯救嵌合病毒的生長(zhǎng)特性34
• 3.1.7 嵌合病毒對(duì)IL-10影響的初步研究34-35
• 3.2 結(jié)果35-40
• 3.2.1 全長(zhǎng)嵌合cDNA質(zhì)粒的線性化35
• 3.2.2 測(cè)序以及genomic marker的檢測(cè)35
• 3.2.3 間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果35-36
• 3.2.4 拯救嵌合病毒生長(zhǎng)特性36-37
• 3.2.5 PRRSV大片段嵌合病毒感染PAM細(xì)胞后IL-10的表達(dá)存在差異37-38
• 3.2.6 PRRSV大片段嵌合病毒感染PAM細(xì)胞后復(fù)制水平存在差異38
• 3.2.7 PRRSV大片段嵌合病毒感染PAM細(xì)胞后p38磷酸化水平存在差異38-39
• 3.2.8 PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白嵌合病毒感染PAM細(xì)胞后IL-10的表達(dá)存在差異39
• 3.2.9 PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白嵌合病毒感染PAM細(xì)胞后復(fù)制水平存在差異39-40
• 3.2.10 PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白嵌合病毒感染PAM細(xì)胞后p38磷酸化水平存在差異40
• 3.4 討論40-43
• 第四章 全文總結(jié)43-44
• 參考文獻(xiàn)44-55
• 致謝55-56
• 作者簡(jiǎn)歷56

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 韋天超;田志軍;安同慶;周艷君;肖燕;姜一峰;郝曉芳;張善瑞;彭金美;仇華吉;童光志;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒Taq Man-MGB熒光定量RT-PCR方法的建立和應(yīng)用[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2008年12期

2 張善瑞;周艷君;朱建平;童武;姜一峰;童光志;;高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鑒定[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2011年07期

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本文編號(hào)：613381