本文關(guān)鍵詞：豬源殺菌通透性增加蛋白N端基因的克隆原核表達(dá)及抗菌活性測定

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【摘要】：隨著當(dāng)代社會出現(xiàn)了大量抗生素的濫用,藥物殘留現(xiàn)象已經(jīng)變得越來越嚴(yán)重。殺菌通透性增加蛋白(BPI)以其作為一種具有天然的防御功能的一種新型物質(zhì)出現(xiàn)。其特點(diǎn)是具有廣譜的抗菌、抗腫瘤、抗寄生蟲等方面的生物學(xué)特性。并且具有細(xì)菌不容易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)而被人們寄希望于在未來能夠取代抗生素,作為一種新型藥物出現(xiàn)。豬源殺菌通透性增加蛋白(BPI)作為一種來自于豬中性粒細(xì)胞中分離得到的一種抗菌活性物質(zhì)。其中,起主要?dú)⒕饔玫臑樨i源殺菌通透性增加蛋白(BPI)N端基因,一般由200～240個(gè)氨基酸組成。大多數(shù)的革蘭陰性菌對BPI-N端蛋白非常的敏感,并且,BPI-N蛋白對少部分的革蘭陽性菌也具有一定的抗菌活性。本實(shí)驗(yàn)通過利用基因工程技術(shù)對BPI-N端基因進(jìn)行克隆表達(dá)以及抗菌活性的研究。為以后豬源殺菌通透性增加(BPI) N端蛋白的實(shí)際生產(chǎn)以及應(yīng)用提供一定理論基礎(chǔ)。1、BPI-N端基因的擴(kuò)增根據(jù)NCBI上已發(fā)表的豬源殺菌通透性增加蛋白(BPI)基因序列,利用軟件,分析得出了豬源殺菌通透性增加蛋白(BPI)N端基因序列。再利用DNAstar、 Primer 5以及Oligo等軟件,設(shè)計(jì)了兩條豬源殺菌通透性增加蛋白(BPI)N端基因的擴(kuò)增引物P1、P2,并加入腸激酶切割位點(diǎn),為后期腸激酶作用提供靶向引導(dǎo),以防表達(dá)產(chǎn)物被組氨酸標(biāo)簽包裹而不具有抗菌活性。從豬的肝臟中抽提RNA,進(jìn)行擴(kuò)增。將其插入pMD19-T載體上進(jìn)行測序。所獲序列與已發(fā)表的豬源殺菌通透性增加蛋白(BPI) N端基因序列(GenBank ID:NM_001159307.1)完全相同。2. BPI-N端基因在大腸桿菌中的克隆、表達(dá)通過利用Primer 5分析軟件選取了Bam HI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。利用BamHI和XhoI分別將含有BPI-N的目的基因重組質(zhì)粒pMD19-T-BPI-N和表達(dá)載體pET-32a進(jìn)行雙酶切后,回收、純化。連接構(gòu)建成原核表達(dá)質(zhì)粒,將其命名為pET-32a-BPI-N。將重組質(zhì)粒pET-32a-BPI-N轉(zhuǎn)化入DH5 a中進(jìn)行篩選,同時(shí)進(jìn)行PCR和單雙酶切鑒定,鑒定成功后,提取重組質(zhì)粒pET-32a-BPI-N。將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)中,經(jīng)IPTG(濃度大約1.5M)誘導(dǎo)。使其表達(dá)BPI-N蛋白。通過SDS-PAGE鑒定以及對表達(dá)條件的優(yōu)化,表明pET-32a-BPI-N已經(jīng)在大腸桿菌中獲得了高效的表達(dá),SDS-PAGE結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物的分子量大約為47.0KD。在上清中表達(dá)含量較高。為了測定BPI-N蛋白的活性。將BPI-N蛋白進(jìn)行鎳離子柱親和層析。從而得到純度較高的融合蛋白。經(jīng)過腸激酶切割,去掉組氨酸標(biāo)簽后,獲得分子量大約26.0KD左右的BPI-N端蛋白。3、豬源殺菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)進(jìn)行抗菌活性研究將經(jīng)過純化切割以后的豬源殺菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)進(jìn)行抗菌活性以及其穩(wěn)定性的研究。結(jié)果表明：豬源殺菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)對實(shí)驗(yàn)的革蘭陰性菌都具有抗菌活性。對少數(shù)的革蘭陽性菌也具有抗菌活性。紫外光照射對豬源殺菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)的抗菌活性有一定的影響,但影響十分微弱。過酸、過堿的條件下會嚴(yán)重影響其抗菌活性,中性條件時(shí),BPI-N蛋白的抗菌活性最強(qiáng)。對溫度的要求較高,當(dāng)處于80℃環(huán)境下15min后,將會失去抗菌活性。
【關(guān)鍵詞】：豬源殺菌通透性增加蛋白 BPI-N蛋白 純化 抑菌 原核表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-25
• 1.1 嗜中性多形核粒細(xì)胞(PMNs)的作用機(jī)制以及內(nèi)源性抗菌肽的簡介13-14
• 1.1.1 嗜中性多形核粒細(xì)胞(PMNs)的作用機(jī)制13-14
• 1.1.2 (PMNs)抗菌肽的簡介14
• 1.2 殺菌/通透性增加蛋白(BPI)的分布及特點(diǎn)14-16
• 1.2.1 殺菌/通透性增加蛋白(BPI)的分布14-15
• 1.2.2 殺菌/通透性增加蛋白(BPI)的特點(diǎn)15
• 1.2.3 殺菌/通透性增加蛋白(BPI)的作用機(jī)理15-16
• 1.3 殺菌/通透性增加蛋白(BPI)的組成及結(jié)構(gòu)16-18
• 1.3.1 殺菌/通透性增加蛋白(BPI)的組成16
• 1.3.2 殺菌/通透性增加蛋白(BPI)的結(jié)構(gòu)16-18
• 1.4 BPI在生物學(xué)活性方面的研究18-24
• 1.4.1 BPI在殺滅GNB方面的作用18-19
• 1.4.2 BPI在中和內(nèi)毒素方面的作用19-21
• 1.4.3 BPI在抗真菌方面的應(yīng)用前景21-22
• 1.4.4 BPI在中和肝素方面的應(yīng)用22-23
• 1.4.5 BPI在抗血管生成方面的應(yīng)用23
• 1.4.6 BPI對革蘭陽性細(xì)菌L-型的殺滅作用23-24
• 1.5 本研究的目的意義24-25
• 2 材料25-29
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料25-26
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株25
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)所需載體25
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)主要培養(yǎng)基25-26
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)主要試劑26
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)主要儀器26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)主要溶液的配制方法26-29
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌培養(yǎng)液以及培養(yǎng)基的配制方法26-27
• 2.3.2 瓊脂糖核酸電泳使用溶液的配制27
• 2.3.3 SDS-PAGE所需溶液的相關(guān)配制27-28
• 2.3.4 BPI-N蛋白純化所需溶液的相關(guān)配制28-29
• 3 實(shí)驗(yàn)方法29-45
• 3.1 BPI-N目的基因的PCR擴(kuò)增29-31
• 3.1.1 BPI-N目的基因的獲取29
• 3.1.2 BPI-N目的基因擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)29
• 3.1.3 BPI-N目的基因的PCR擴(kuò)增29-30
• 3.1.4 BPI-N目的基因的凝膠回收30-31
• 3.2 pMD19-BPI-N重組載體質(zhì)粒的構(gòu)建31-35
• 3.2.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)的制備31
• 3.2.2 重組子質(zhì)粒的連接31-32
• 3.2.3 重組子質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化32
• 3.2.4 重組載體的篩選32-33
• 3.2.5 重組載體的鑒定33-35
• 3.3 BPI-N目的基因的原核表達(dá)35-40
• 3.3.1 感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)的制備35
• 3.3.2 pET-32a-BPI-N原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建35-37
• 3.3.3 雙酶切膠回收產(chǎn)物BPI-N目的基因37
• 3.3.4 雙酶切膠回收pET-32a空載體37
• 3.3.5 目的基因BPI-N與pET-32a的連接37-38
• 3.3.6 目的基因BPI-N與pET-32a的轉(zhuǎn)化38
• 3.3.7 重組子表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-BPI-N的篩選38
• 3.3.8 重組子表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-BPI-N的鑒定38-39
• 3.3.9 重組質(zhì)粒pET-32a-BPI-N的原核表達(dá)39-40
• 3.4 重組宿主菌表達(dá)產(chǎn)物的檢測40-43
• 3.4.1 重組宿主菌BL21(DE3)表達(dá)產(chǎn)物檢測40-41
• 3.4.2 重組蛋白表達(dá)形式的判定41
• 3.4.3 BPI-N重組蛋白誘導(dǎo)時(shí)間以及IPTG濃度的優(yōu)化41-42
• 3.4.4 BPI-N端融合蛋白的純化42-43
• 3.4.5 BPI-N端融合蛋白的切割43
• 3.5 豬源殺菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)的抑菌活性43-44
• 3.5.1 豬源殺菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)對細(xì)菌抑制活性的測定43-44
• 3.6 豬源殺菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)穩(wěn)定性的研究44-45
• 3.6.1 熱處理對BPI-N抑菌活性的影響44
• 3.6.2 不同的PH值對BPI-N抑菌活性的影響44
• 3.6.3 紫外光線照射對BPI-N抑菌活性的影響44-45
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-60
• 4.1 BPI-N端基因的克隆以及鑒定45-49
• 4.1.1 BPI-N端目的基因的獲取(PCR擴(kuò)增)45
• 4.1.2 pMD19-T-BPI-N端質(zhì)粒的構(gòu)建45
• 4.1.3 pMD19-T-BPI-N端質(zhì)粒的鑒定45-47
• 4.1.4 pET-32a-BPI-N重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定47-49
• 4.2 重組質(zhì)粒pET-32a-BPI-N端的原核表達(dá)49-55
• 4.2.1 融合表達(dá)產(chǎn)物pET-32a-BPI-N的SDS-PAGE鑒定49-50
• 4.2.2 關(guān)于重組融合蛋白存在形式的判定50-51
• 4.2.3 對重組蛋白誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度的優(yōu)化51-53
• 4.2.4 純化重組融合蛋白53-54
• 4.2.5 重組融合蛋白的切割54-55
• 4.3 豬源殺菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)對細(xì)菌抑制活性的檢測55-57
• 4.4 豬源殺菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)穩(wěn)定性的研究57-60
• 4.4.1 熱處理對豬源殺菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)抑菌活性的影響57-58
• 4.4.2 紫外光照射對豬源殺菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)抗菌活性的影響58-59
• 4.4.3 不同PH值的處理對豬源殺菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)抗菌活性的影響59-60
• 5 討論60-62
• 5.1 外源基因融合表達(dá)的意義60-61
• 5.2 pET-32a-BPI-N重組蛋白的純化以及切割61
• 5.3 對重組蛋白的抗菌活性以及穩(wěn)定性的研究61-62
• 6 結(jié)論62-64
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 致謝68

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：598910