本文關(guān)鍵詞：枸櫞C-05抗?jié)儾》烙嚓P(guān)基因的鑒定與表達(dá)分析

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【摘要】：柑橘潰瘍病(Citrus bacterial canker disease, CBCD)是由柑橘潰瘍病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri, Xac)引起的一種世界性檢疫病害,危害嚴(yán)重,防治困難,對于非疫區(qū)要嚴(yán)格禁止攜帶潰瘍病菌的柑橘材料的流入,加強(qiáng)對柑橘潰瘍病菌的檢測。但這只是治標(biāo)不治本,要從根本上解決問題,急需找到抗病柑橘資源、培育抗病品種。枸櫞C-05是由國家柑橘改良中心長沙分中心經(jīng)過多年篩選,最終確定的對潰瘍病菌表現(xiàn)過敏反應(yīng)的獨(dú)有抗病種質(zhì)。探討枸櫞C-05的抗病機(jī)理,有望挖掘抗病相關(guān)基因,為抗病分子育種提供基因資源和理論指導(dǎo),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)柑橘抗?jié)儾∮N的突破,解決這一產(chǎn)業(yè)難題。本研究以柑橘潰瘍病抗病種質(zhì)枸櫞C-05對比感病種質(zhì)冰糖橙在接種潰瘍病菌后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室GO功能分類、pathway代謝通路分析的結(jié)果鎖定了幾個(gè)可能與柑橘潰瘍病抗病相關(guān)的候選基因。對候選基因的蛋白結(jié)構(gòu)與功能作了生物信息學(xué)分析,采用定量PCR技術(shù)分析了這幾個(gè)基因在接種flg22溶液或不同濃度的潰瘍病菌液后的抗、感病柑橘材料中的表達(dá)模式,同時(shí)也對qPCR技術(shù)檢測柑橘潰瘍病菌的靈敏度進(jìn)行了摸索。主要研究結(jié)論如下：1.在響應(yīng)潰瘍病菌侵染的過程中,FLS2在注射接種和噴霧接種后都表現(xiàn)枸櫞C-05中的上調(diào)表達(dá)階段對應(yīng)冰糖橙中的下調(diào)表達(dá)；EFR在注射接種后的枸櫞C-05和冰糖橙中均上調(diào)表達(dá),且趨勢非常接近,但在噴霧接種后表現(xiàn)枸櫞C-05中的上調(diào)表達(dá)階段對應(yīng)冰糖橙中的下調(diào)表達(dá)；BAK1在注射接種后的枸櫞C-05和冰糖橙中均上調(diào)表達(dá),在噴霧接種后的枸櫞C-05和冰糖橙中均下調(diào)表達(dá),且趨勢非常接近。2.在響應(yīng)flg22的過程中,4個(gè)柑橘防御相關(guān)候選基因FLS2、BAK1、CERK1和LYP2在注射接種后的抗病材料枸櫞C-05和感病材料冰糖橙中,均受誘導(dǎo)而表現(xiàn)差異表達(dá),表現(xiàn)為枸櫞C-05中的上調(diào)表達(dá)階段對應(yīng)冰糖橙中的下調(diào)表達(dá),只是存在量的差異及枸櫞C-05出現(xiàn)表達(dá)峰值的時(shí)間點(diǎn)的差異,說明flg22在葉肉中具有PAMP作用,且其對FLS2和BAK1的誘導(dǎo)效率和強(qiáng)度比潰瘍病菌高,但對CERK1和LYP2沒有太大作用。4個(gè)基因在噴霧接種后的兩種柑橘材料中,都表現(xiàn)下調(diào)表達(dá),且趨勢非常接近,可以認(rèn)為flg22在葉表對這幾個(gè)基因的表達(dá)不起誘導(dǎo)作用。3. qPCR檢測柑橘潰瘍病菌的靈敏度分析表明,qPCR檢測柑橘潰瘍病菌DNA和柑橘潰瘍病菌菌量的靈敏度比常規(guī)PCR高10～1000倍,且常規(guī)PCR對柑橘潰瘍病菌DNA的檢測會(huì)受到植物DNA的影響,qPCR不受植物DNA影響；對低菌量接種的冰糖橙樣品進(jìn)行分析,qPCR即時(shí)就能檢測到柑橘潰瘍病菌,并能觀察到柑橘潰瘍病菌先慢后快的增殖趨勢,而常規(guī)PCR要接種后2d才能檢測到柑橘潰瘍病菌,該技術(shù)適用于潰瘍病菌量對基因表達(dá)影響的研究。在用不同濃度的潰瘍病菌液對兩種柑橘材料實(shí)施接種后,低濃度接種時(shí)細(xì)菌增殖的速度比高濃度接種時(shí)更快,潰瘍病菌在冰糖橙中增殖的速度比在枸櫞C05中更快。本研究分析的3個(gè)假定的柑橘防御相關(guān)基因FLS2、 EFR和BAKl在抗病材料枸櫞C-05和感病材料冰糖橙中,均受潰瘍病菌的誘導(dǎo)而表現(xiàn)差異表達(dá),表現(xiàn)為枸櫞C-05中的上調(diào)表達(dá)時(shí)間點(diǎn)對應(yīng)冰糖橙中的下調(diào)表達(dá)。在接種濃度為1010cfu/ml時(shí)枸櫞C-05中這三個(gè)基因的表達(dá)量均較另兩個(gè)接種濃度高,在接種濃度為108cfu/ml時(shí)冰糖橙中這三個(gè)基因的表達(dá)量較另兩個(gè)接種濃度低。
【關(guān)鍵詞】：柑橘 抗病相關(guān)基因 定量PCR 表達(dá)分析 檢測
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S436.66
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-23
• 1.1 植物先天免疫系統(tǒng)研究進(jìn)展11-20
• 1.1.1 PAMPs引發(fā)的生理反應(yīng)12-15
• 1.1.2 PTI反應(yīng)中的早期信號機(jī)制15-20
• 1.2 柑橘潰瘍病菌檢測的研究現(xiàn)狀20-22
• 1.3 研究目的及意義22-23
• 第二章 潰瘍病菌侵染后枸櫞C-05中防御相關(guān)候選基因的表達(dá)分析23-34
• 2.1 材料與方法23-26
• 2.1.1 植物材料23
• 2.1.2 供試菌種23
• 2.1.3 潰瘍病菌液的制備23-24
• 2.1.4 活體接種與樣品采集24
• 2.1.5 樣品總RNA的提取24-25
• 2.1.6 cDNA的合成25
• 2.1.7 防御候選基因序列檢索及引物合成25-26
• 2.1.8 候選基因的生物信息學(xué)分析26
• 2.1.9 引物特異性驗(yàn)證及基因表達(dá)分析26
• 2.2 結(jié)果與分析26-31
• 2.2.1 接種后的癥狀觀察26-27
• 2.2.2 防御相關(guān)候選基因蛋白結(jié)構(gòu)分析及功能預(yù)測27-28
• 2.2.3 防御相關(guān)候選基因引物特異性驗(yàn)證28
• 2.2.4 候選基因?qū)儾【秩镜捻憫?yīng)28-31
• 2.3 討論31-33
• 2.4 小結(jié)33-34
• 第三章 flg22對枸櫞C-05中防御相關(guān)候選基因表達(dá)的誘導(dǎo)34-42
• 3.1 材料與方法34-37
• 3.1.1 植物材料34
• 3.1.2 flg22多肽34
• 3.1.3 flg22多肽處理液的制備34
• 3.1.4 活體接種與樣品采集34-35
• 3.1.5 樣品RNA的提取35-36
• 3.1.6 cDNA的合成36
• 3.1.7 基因表達(dá)分析36-37
• 3.2 結(jié)果與分析37-39
• 3.2.1 接種后的癥狀觀察37
• 3.2.2 候選基因?qū)lg22的響應(yīng)37-39
• 3.3 討論39-41
• 3.4 小結(jié)41-42
• 第四章 潰瘍病菌濃度對防御相關(guān)候選基因表達(dá)的影響42-54
• 4.1 材料與方法42-44
• 4.1.1 植物材料42
• 4.1.2 供試菌種42
• 4.1.3 潰瘍病菌液的制備42
• 4.1.4 活體接種與樣品采集42-43
• 4.1.5 基因組DNA的提取43
• 4.1.6 qPCR檢測潰瘍病菌的反應(yīng)程序43
• 4.1.7 常規(guī)PCR檢測潰瘍病菌的反應(yīng)程序43-44
• 4.2 結(jié)果與分析44-52
• 4.2.1 PCR檢測柑橘潰瘍病菌DNA的靈敏度分析44-46
• 4.2.2 PCR檢測柑橘潰瘍病菌量的靈敏度分析46-48
• 4.2.3 利用PCR對冰糖橙接種后進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測48-49
• 4.2.4 不同濃度的潰瘍病菌液對柑橘抗?jié)儾》烙嚓P(guān)基因的誘導(dǎo)分析49-52
• 4.3 討論52-53
• 4.4 小結(jié)53-54
• 總結(jié)與展望54-55
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 附錄61-65
• 致謝65-66
• 個(gè)人簡歷66

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 馬利;寧紅;郭迪金;熊玉蘭;張敏;王中康;;柑橘潰瘍病菌檢測方法及其在檢疫中的優(yōu)選[J];植物保護(hù);2006年04期

2 林文力;肖伏蓮;;柑橘潰瘍病菌檢測方法及防治技術(shù)研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2012年22期

3 羅志萍;洪霓;;柑橘潰瘍病菌免疫熒光和生物學(xué)檢測技術(shù)研究[J];植物檢疫;2006年05期

4 陳雪鳳;雷艷宜;葉Q，

本文編號：568436