發(fā)布時(shí)間：2017-07-16 03:05

  本文關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立

  更多相關(guān)文章： PCV2 Cap蛋白 優(yōu)化表達(dá) 抗原性 ROC ELISA

【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)被公認(rèn)為在世界范圍養(yǎng)豬業(yè)中造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)影響的最重要的病毒之一。由于病毒、宿主的免疫力、混合感染情況和其他環(huán)境特征的差異,PCV2能引起不同的疾病,統(tǒng)稱為圓環(huán)病毒病(porcine circovirus diseases, PCVDs)。我國(guó)是一個(gè)養(yǎng)豬大國(guó),PCVDs在我國(guó)一直呈上升趨勢(shì),給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。血清抗體的檢測(cè)常被用來(lái)分析PCV2的感染情況以及評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果。ELISA因其敏感、特異、檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),而被廣泛應(yīng)用。然而研究表明,國(guó)內(nèi)檢測(cè)PCV2抗體的ELISA試劑盒普遍存在敏感性偏低的問(wèn)題,而進(jìn)口試劑盒因其價(jià)格昂貴,難于普及應(yīng)用。因此,建立一種快速、簡(jiǎn)便、敏感、特異的診斷方法對(duì)于PCV2的預(yù)防和控制具有重要意義。本研究利用PCR方法擴(kuò)增PCV2 ORF2全長(zhǎng)基因,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a-Cap,轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)。在SDS-PAGE分析基礎(chǔ)上,結(jié)合ImageJ和Graphpad prism 5.0軟件的分析,對(duì)影響重組Cap蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)溫度,誘導(dǎo)起始OD600， IPTG濃度及誘導(dǎo)時(shí)間等因素進(jìn)行了優(yōu)化,確定最佳表達(dá)條件為：當(dāng)菌體濃度達(dá)到1.0～1.5時(shí),加入終濃度為0.2 mM的IPTG,37℃恒溫?fù)u床175 rpm振蕩培養(yǎng)5h。為得到高純度的重組Cap蛋白,對(duì)重組Cap蛋白純化條件進(jìn)行了探索,確定蛋白洗滌液中咪唑濃度為100 mM,蛋白洗脫液中咪唑濃度為300 mM。純化后的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定,重組Cap蛋白只與PCV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng),與E.coli BL21(DE3)陽(yáng)性血清和pET-30a/ BL21(DE3)陽(yáng)性血清均不發(fā)生反應(yīng),表明純化的重組Cap蛋白具有良好的特異性和反應(yīng)原性。以純化的重組Cap蛋白為包被抗原,優(yōu)化試驗(yàn)條件,建立了PCV2 Cap-ELISA檢測(cè)方法：抗原包被條件為3 μg/mL,4℃包被過(guò)夜；封閉液為5%馬血清+2.5%BD脫脂乳,37℃封閉2 h；血清作用條件為200×,37℃孵育45 min；兔抗豬HRP-IgG稀釋度為5000×,37℃孵育45 min；顯色條件為37℃,15 min；利用TG-ROC方法確定臨界值為0.26即當(dāng)S/P≥0.26時(shí),結(jié)果判定為陽(yáng)性；S/P0.26時(shí),結(jié)果判定為陰性。該方法與PRV陽(yáng)性血清、TGEV陽(yáng)性血清、RV陽(yáng)性血清、PPV陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。組裝的試劑盒的批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果變異系數(shù)分別為0.32%-7.8%和1.09%-7.71%,具有良好重復(fù)性。在與8種市售試劑盒的符合率對(duì)比試驗(yàn)中,同3種進(jìn)口試劑盒的符合率分別為89.22%、83.83%和89.22%,符合率較高且一致；同5種國(guó)產(chǎn)試劑盒的符合率分別為67.67%、80.23%、54.49%、65.87%、71.25%和84.43%,符合率參差不齊。表明,PCV2 Cap-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果可靠,能用于臨床樣品的檢測(cè)。
【關(guān)鍵詞】：PCV2 Cap蛋白 優(yōu)化表達(dá) 抗原性 ROC ELISA
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.651
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1 緒論10-18
• 1.1 課題背景10
• 1.2 PCV2病毒學(xué)概論10-11
• 1.3 PCV2流行情況11-12
• 1.4 PCV2感染情況12-13
• 1.4.1 宿主的易感性12
• 1.4.2 傳播途徑12-13
• 1.5 PCV2診斷技術(shù)13-16
• 1.5.1 臨床診斷及病理組織變化13-14
• 1.5.2 病毒分離與鑒定14
• 1.5.3 血清學(xué)診斷技術(shù)14-15
• 1.5.4 PCV2病原學(xué)診斷技術(shù)15-16
• 1.6 PCV2防治與控制16-17
• 1.7 研究目的與意義17-18
• 2 豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的原核表達(dá)及重組菌遺傳穩(wěn)定性鑒定18-32
• 2.1 材料18
• 2.1.1 血清、質(zhì)粒和菌株18
• 2.1.2 主要試劑18
• 2.1.3 主要儀器18
• 2.2 方法18-23
• 2.2.1 PCV2 Cap蛋白基因的獲取18-19
• 2.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定19-20
• 2.2.3 重組Cap蛋白的表達(dá)20-21
• 2.2.4 重組Cap蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化21-22
• 2.2.5 重組Cap蛋白的純化22-23
• 2.2.6 純化產(chǎn)物的抗原性鑒定23
• 2.2.7 重組質(zhì)粒pET-30a-Cap穩(wěn)定性鑒定23
• 2.3 結(jié)果23-30
• 2.3.1 PCV2 Cap基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果23-24
• 2.3.2 重組質(zhì)粒pET-30a-Cap的鑒定24
• 2.3.3 重組Cap蛋白的SDS-PAGE分析24-25
• 2.3.4 重組Cap蛋白的Western blot鑒定25
• 2.3.5 重組Cap蛋白表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果25-27
• 2.3.6 重組Cap蛋白的純化條件27-28
• 2.3.7 重組Cap蛋白大量純化結(jié)果28
• 2.3.8 重組Cap蛋白抗原性鑒定結(jié)果28-29
• 2.3.9 重組質(zhì)粒pET-30a-Cap穩(wěn)定性鑒定29-30
• 2.4 討論30-31
• 2.5 本章小結(jié)31-32
• 3 豬圓環(huán)病毒2型間接ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用32-47
• 3.1 材料32
• 3.1.1 血清32
• 3.1.2 主要試劑32
• 3.1.3 主要儀器32
• 3.2 方法32-35
• 3.2.1 重組Cap蛋白間接ELISA方法的建立及條件優(yōu)化32-33
• 3.2.2 陰陽(yáng)性臨界值的確定33
• 3.2.3 敏感性試驗(yàn)33-34
• 3.2.4 特異性試驗(yàn)34
• 3.2.5 PCV2 Cap-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的組份34
• 3.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)34
• 3.2.7 保存期試驗(yàn)34-35
• 3.2.8 與商品化試劑盒符合率比較35
• 3.3 結(jié)果35-45
• 3.3.1 重組Cap蛋白間接ELISA方法的建立及條件優(yōu)化結(jié)果35-39
• 3.3.2 陰陽(yáng)性臨界值的確定39-40
• 3.3.3 敏感性試驗(yàn)40-41
• 3.3.4 特異性試驗(yàn)41-42
• 3.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)42-44
• 3.3.6 保存期試驗(yàn)44
• 3.3.7 與商品化試劑盒符合率比較44-45
• 3.4 討論45-46
• 3.5 本章小結(jié)46-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-55
• 附錄55-56
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文56-57
• 致謝57-58

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：546797