本文關(guān)鍵詞：葡萄VvCOR27基因的克隆與抗寒功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：冬季低溫是制約我國(guó)葡萄和葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。揭示葡萄在冷脅迫下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、挖掘抗寒相關(guān)基因并解析其功能,對(duì)高耐寒葡萄品種的培育具有重要理論和應(yīng)用價(jià)值。COR基因是最先在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的響應(yīng)冷脅迫的轉(zhuǎn)錄因子,CBF通過(guò)結(jié)合COR基因啟動(dòng)子中DRE/CRT結(jié)構(gòu)元件誘導(dǎo)其表達(dá),從而增強(qiáng)植株抗性。本文通過(guò)對(duì)歐亞種‘玫瑰香’葡萄(Vitis vinifera L.cv.Muscat Hamburg)轉(zhuǎn)錄組分析鑒定了一個(gè)響應(yīng)冷脅迫的抗寒候選基因VvCOR27。通過(guò)對(duì)‘玫瑰香’葡萄VvCOR27基因進(jìn)行分子克隆和結(jié)構(gòu)分析,鑒定其抗寒功能。主要成果有：克隆出了VvCOR27基因,其全長(zhǎng)序列為1202 bp,編碼302個(gè)氨基酸殘基,編碼蛋白質(zhì)大小為33 KD,發(fā)現(xiàn)其為穩(wěn)定性較差的親水性蛋白,具體功能有待挖掘；挖掘了12種與VvCOR27具有同源性的COR27蛋白,發(fā)現(xiàn)了3個(gè)特有的保守結(jié)構(gòu)域,其中與梅花的PmCOR27同源性最高,暗示它們可能有相似的功能；定量RT-PCR結(jié)果表明VvCOR27的表達(dá)量在4℃處理24h后大量增加。基于基因組序列的啟動(dòng)子基序分析表明,VvCOR27啟動(dòng)子區(qū)域含有包括EE、EEL、G-box以及ABREL元件,但是其數(shù)量比AtCOR27要少,可能是其對(duì)冷脅迫的響應(yīng)較AtCOR27滯后的原因。預(yù)測(cè)COR27基因參與冷調(diào)控途徑,其表達(dá)量可能受脫落酸(ABA)的影響。該研究為VvCOR27轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。擬南芥是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的自花受粉植物,基因高度純合,用理化因素處理突變率很高,容易獲得各種代謝功能的缺陷型,通過(guò)獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥驗(yàn)證相關(guān)基因功能是一種操作較便可信度較高的生物工程研究方法。本文通過(guò)構(gòu)建超表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥,得到了3個(gè)超表達(dá)VvCOR27的株系。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒性檢測(cè)表明,超表達(dá)VvCOR27增加了植株的抗寒能力；生理指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥具有更高的抗氧化酶活性和較低的膜脂過(guò)氧化程度,證實(shí)VvCOR27的過(guò)表達(dá)能明顯增強(qiáng)植株的抗寒性；驗(yàn)證VvCOR27在植株響應(yīng)冷脅迫途徑中為正調(diào)控因子。該研究能夠提高植物抗寒性的相關(guān)科研工作的進(jìn)展,為植物抗逆性的研究工作提供新的思路和基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：VvCOR27 ‘玫瑰香’葡萄 轉(zhuǎn)基因擬南芥 抗寒性
【學(xué)位授予單位】：西南交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S663.1;Q943.2
【目錄】：

• 摘要7-8
• Abstract8-12
• 第1章 緒論12-17
• 1.1 我國(guó)葡萄栽培情況概況12-13
• 1.1.1 我國(guó)葡萄栽培情況及問題12
• 1.1.2 提高葡萄抗寒性的研究進(jìn)展及意義12-13
• 1.2 葡萄抗寒機(jī)制的研究概況13-15
• 1.3 本課題的研究目的和意義15-17
• 第2章 葡萄抗寒基因的挖掘和分子克隆17-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑17
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器17
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑17
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法17-24
• 2.3.1 總RNA的提取和cDNA的生成17-19
• 2.3.2 VvCOR27基因的克隆19-20
• 2.3.3 PCR產(chǎn)物的回收及載體的連接20-21
• 2.3.4 DH5α感受態(tài)的制備及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化21-22
• 2.3.5 菌液檢測(cè)及測(cè)序22
• 2.3.6 生物信息學(xué)分析22-23
• 2.3.7 定量RT-PCR分析23-24
• 2.4 結(jié)果與分析24-31
• 2.4.1 總RNA的提取24
• 2.4.2 VvCOR27基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)克隆24-25
• 2.4.3 VvCOR27基因的cDNA克隆25
• 2.4.4 VvCOR27基因的同源比對(duì)分析25-29
• 2.4.5 冷處理下VvCOR27基因的表達(dá)模式分析29-30
• 2.4.6 VvCOR27啟動(dòng)子調(diào)控元件分析30-31
• 2.5 討論31-32
• 第3章 VvCOR27表達(dá)載體的構(gòu)建及超表達(dá)擬南芥的鑒定32-47
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料32
• 3.1.1 菌種及載體32
• 3.1.2 試劑及儀器32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法32-41
• 3.2.1 野生型擬南芥的培育32-33
• 3.2.2 質(zhì)粒的提取33-34
• 3.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建34-35
• 3.2.4 轉(zhuǎn)化大腸桿菌及表達(dá)載體的驗(yàn)證35
• 3.2.5 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化35-36
• 3.2.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥36-37
• 3.2.7 超表達(dá)VvCOR27擬南芥的獲得及鑒定37-38
• 3.2.8 超表達(dá)VvCOR27擬南芥抗寒表型的鑒定38
• 3.2.9 超表達(dá)VvCOR27擬南芥生理指標(biāo)的測(cè)定38-41
• 3.3 結(jié)果與分析41-45
• 3.3.1. 超表達(dá)VvCOR27擬南芥潮霉素抗性基因檢測(cè)41-42
• 3.3.2 超表達(dá)VvCOR27擬南芥PCR檢測(cè)42-43
• 3.3.3 超表達(dá)VvCOR27擬南芥抗寒性鑒定43-44
• 3.3.4 超表達(dá)VvCOR27擬南芥生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果44-45
• 3.4 討論45-47
• 第4章 結(jié)論與展望47-49
• 4.1 研究結(jié)論47-48
• 4.2 研究展望48-49
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 致謝54-55
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文55-56
• 附錄56-58
• 縮略詞及中英文全稱58

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