本文關(guān)鍵詞：半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）R-spondin2基因的分子克隆、表達模式及其在肌肉發(fā)育過程中功能的初步探究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：R-spondin2基因是Rspo基因家族中一員。R-spondin(Rspo)蛋白家族共有4個成員(Rspo 1-4),均為分泌性蛋白,其蛋白結(jié)構(gòu)均含有以下幾個典型結(jié)構(gòu)域：N端含有20-25個氨基酸的信號肽區(qū),富含半胱氨酸的弗林類似結(jié)構(gòu)域FU區(qū)、I型血小板反應(yīng)結(jié)構(gòu)域TSP1 (thrombospondin type 1 domain)和C端富含可變數(shù)量堿性氨基酸的區(qū)域。在小鼠、爪蟾等生物體中的研究顯示Rspos可以通過激活以及協(xié)同Wnt/β-catenin信號通路,從而參與對細胞增殖和分化的調(diào)控,參與影響骨骼、肌肉、血管等組織的發(fā)育以及參與四肢和雌雄性腺的分化、發(fā)育,并可能在多種疾病的發(fā)生過程中起著至關(guān)重要的作用。例如,在爪蟾的研究中發(fā)現(xiàn),Rspo2通過激活經(jīng)典Wnt信號通路,促進β-catenin介導(dǎo)的胚胎肌肉發(fā)生,而敲降Rspo2可以顯著地阻抑這一過程,表明Rspo2對于依賴于Wnt的胚胎肌肉發(fā)生過程非常必要。在小鼠中,敲除對卵母細胞發(fā)生起重要作用的Nobox基因后,小鼠卵巢中Rspo2表達水平顯著下降,顯示Rspo2可能在Nobox下游調(diào)控卵母細胞發(fā)育,參與雌性生殖系統(tǒng)發(fā)育。此外,半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是我國北方主要的海水養(yǎng)殖名貴魚類品種之一,具有很高的實用價值和經(jīng)濟價值。然而,半滑舌鰨體重存在雌雄個體二相性差異,對于養(yǎng)殖的半滑舌鰨來說,同齡的成年雌雄個體要比雄性個體大。另外,對于水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類來說,獲得健康豐富的肌肉也是比較關(guān)注的一點。所以,基于以上情況,本研究試圖著重探究R-spondin2基因在半滑舌鰨雌雄性腺分化以及肌肉發(fā)育方面潛在的功能。本實驗中,通過基因克隆技術(shù)得到能夠編碼完整R-spondin2蛋白氨基酸的ORF序列,對預(yù)測的氨基酸序列分析可知其含有Rspo蛋白家族典型的結(jié)構(gòu),3D蛋白結(jié)構(gòu)模型顯示其與斑馬魚、青鯔等物種之間具有高度的蛋白保守性。實時定量PCR實驗表明,在胚胎早期發(fā)育過程中,R-spondin2基因處于低水平表達,直至原腸發(fā)生；在組織中出現(xiàn)腦、鰓、性腺的高表達水平。性腺切片原位雜交結(jié)果顯示了R-spondin2在精巢和卵巢的生殖細胞中的廣泛表達,暗示其在性腺發(fā)育中的潛在作用。此外,利用斑馬魚這一模式生物作為研究平臺,為研究海洋經(jīng)濟魚類基因功能提供了可能。我們以顯微注射技術(shù)為基礎(chǔ),結(jié)合斑馬龜整胚染色實驗以及胚胎整體原位雜交技術(shù),初步探究得知半滑舌鰨R-spondin2基因?qū)τ谠缙诩∪獍l(fā)育具有潛在重要影響。
【關(guān)鍵詞】：R-spondin2 半滑舌鰨 Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 研究背景11-23
• 1. R-spondin基因家族介紹以及研究進展11-15
• 1.1 R-spondin基因蛋白家族的結(jié)構(gòu)和特點11-13
• 1.2 R-spondin基因家族蛋白各成員功能研究進展13-15
• 2. R-spondin基因家族與Wnt信號通路的聯(lián)系15-20
• 2.1 Wnt信號通路簡介15-18
• 2.2 R-spondin基因家族與Wnt信號通路關(guān)系的研究進展18-20
• 3. 本研究的意義以及實驗設(shè)計思路20-23
• 第二章 半滑舌鰨R-spondin2基因的分子克隆、表達模式及功能的初步探究23-63
• 1. 實驗材料與方法23-43
• 1.1 實驗材料23-25
• 1.2 實驗方法25-43
• 1.2.1 半滑舌鰨總RNA的提取、純化及cDNA的合成25-28
• 1.2.2 半滑舌鰨R-spondin2基因片段克隆28-31
• 1.2.3 半滑舌鰨R-spondin2基因蛋白編碼序列分析31
• 1.2.4 半滑舌鰨R-spondin2基因在不同組織和不同發(fā)育時序的表達分析31-32
• 1.2.5 半滑舌鰨R-spondin2基因在性腺組織中的表達分析32-39
• 1.2.6 斑馬魚胚胎顯微注射39-40
• 1.2.7 注射后斑馬魚肌肉標記基因MyoD的空間表達分析40-42
• 1.2.8 注射后斑馬魚肌肉纖維整胚染色分析42-43
• 2. 實驗結(jié)果及討論43-63
• 2.1 半滑舌鰨R-spondin2基因結(jié)構(gòu)分析43-49
• 2.1.1 半滑舌鰨R-spondin2基因完整ORF序列的分析結(jié)果43-46
• 2.1.2 半滑舌鰨R-spondin2基因蛋白3D模型預(yù)測及其與其他物種間比對46-47
• 2.1.3 R-spondin2基因在多物種間的染色體共線性分析47-49
• 2.1.4 討論49
• 2.2 半滑舌鰨R-spondin2基因定量表達分析49-52
• 2.2.1 半滑舌鰨R-spondin2基因在不同組織中的表達水平分析49-50
• 2.2.2 半滑舌鰨R-spondin2基因在早期胚胎發(fā)育各時段的表達水平分析50-51
• 2.2.3 討論51-52
• 2.3 半滑舌鰨R-spondin2基因組織表達分析52-54
• 2.3.1 半滑舌鰨R-spondin2基因在精巢組織的空間表達分析52-53
• 2.3.2 半滑舌鰨R-spondin2基因在卵巢組織的空間表達分析53-54
• 2.3.3 討論54
• 2.4 半滑舌鰨R-spondin2基因在肌肉發(fā)育過程中功能的初步探究54-59
• 2.4.1 注射后斑馬魚肌肉標記基因MyoD空間表達分析54-57
• 2.4.2 注射后斑馬魚肌肉纖維整胚染色分析57-58
• 2.4.3 討論58-59
• 2.5 R-spondin2抑制Wnt3A對經(jīng)典Wnt信號通路的激活59-63
• 參考文獻63-72
• 個人簡歷72-73
• 致謝73

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本文編號：493088