本文關(guān)鍵詞：高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP2抗體制備與重組分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的急性傳染病。該病毒分為歐洲型和美洲型兩種基因型。2006年,我國(guó)爆發(fā)高致病性PRRS,給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)極大的沖擊。NSP2是PRRSV中分子量最大、變異最大的蛋白,常作為PRRSV監(jiān)控的靶點(diǎn),同時(shí)其在PRRSV的復(fù)制、免疫、引發(fā)宿主細(xì)胞自噬和凋亡中發(fā)揮著重要功能。本研究分離鑒定了1株2012年黑龍江省的美洲型HP-PRRSV,并命名為HH12株。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)成功克隆HH12株和實(shí)驗(yàn)室已鑒定的2株HP-PRRSV(Jilin TN1株和Jilin TN2株)的NSP2全長(zhǎng)基因,測(cè)序結(jié)果3個(gè)分離株NSP2全長(zhǎng)均為2850 bp。將所克隆序列與美洲經(jīng)典型PRRSV NSP2比對(duì),發(fā)現(xiàn)3個(gè)分離株的NSP2基因均存在HP-PRRSV特征性的30個(gè)氨基酸缺失。遺傳進(jìn)化分析表明,3個(gè)分離株與HP-PRRSV代表株JXA1 NSP2基因序列相似性為98.5%~98.7%,且在遺傳進(jìn)化樹中屬于JXA1株為代表的亞群,并與HB0701株處于同一分支。以Jilin TN1株為研究對(duì)象,設(shè)計(jì)并合成能夠擴(kuò)增刪除了部分疏水區(qū)的NSP2片段的特異性引物,應(yīng)用RT-PCR對(duì)其進(jìn)行亞克隆,構(gòu)建p GEX 6p-NSP2重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至E.coli Rostta感受態(tài)細(xì)胞中通過原核表達(dá)重組NSP2蛋白,SDS-PAGE分析其大小約131.5 ku,經(jīng)Western-blot鑒定純化復(fù)性后的重組蛋白能夠與PRRSV陽(yáng)性血清反應(yīng)。以該蛋白為免疫原,免疫新西蘭兔制備抗血清,4免后檢測(cè)其效價(jià)達(dá)1:215,且與HP-PRRSV及經(jīng)典型PRRSV反應(yīng)效價(jià)可達(dá)1:211。western-blot結(jié)果表明所獲抗血清特異性較高。IFA結(jié)果顯示該多抗能夠檢測(cè)到Marc-145細(xì)胞上繁殖的HP-PRRSV和經(jīng)典型PRRSV,且能夠與p VAX-NSP2轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)的NSP2蛋白反應(yīng)。Real-time PCR結(jié)果顯示該抗體對(duì)HP-PRRSV和經(jīng)典型PRRSV具有較好的抑制效果,對(duì)兩者的最高抑制率分別為76.0%和58.6%。以上結(jié)果說(shuō)明所制備的多抗生物學(xué)活性良好,為NSP2的深入研究提供很重要的基礎(chǔ)。以Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中包括本研究克隆的624條美洲型PRRSV NSP2序列為研究對(duì)象,應(yīng)用RDP4.2軟件對(duì)NSP2重組事件進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)應(yīng)用SIMPLOT軟件和MEGA5.2軟件從遺傳相似性和遺傳進(jìn)化兩個(gè)角度對(duì)重組事件進(jìn)行驗(yàn)證和分析。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)11個(gè)重組事件,共包含37個(gè)重組毒株,占總分析毒株的5.9%(37/624),而本研究3個(gè)分離株的NSP2基因未發(fā)現(xiàn)重組。美洲變異型、傳統(tǒng)型和經(jīng)典型毒株均發(fā)現(xiàn)了重組:其中傳統(tǒng)型有3株,經(jīng)典型有7株,變異型有27株。這些重組事件中不僅存在7個(gè)型內(nèi)重組,還發(fā)現(xiàn)了4個(gè)型間重組,檢測(cè)到的型間重組毒株主要由美洲變異型與傳統(tǒng)型或經(jīng)典型通過重組產(chǎn)生。遺傳進(jìn)化分析表明,發(fā)生型間重組的毒株具有獨(dú)特的進(jìn)化地位。以上結(jié)果提示,在美洲型PRRSV的進(jìn)化過程中NSP2基因片段有重組發(fā)生,變異型毒株的出現(xiàn)加快了PRRSV的進(jìn)化速度并且使其變異情況更加復(fù)雜。同時(shí),基因重組可能是PRRSV發(fā)生型間轉(zhuǎn)換、甚至產(chǎn)生新基因型的進(jìn)化基礎(chǔ),這可能會(huì)造成新型PRRSV的爆發(fā),這一結(jié)果提示需針對(duì)PRRSV的變異提出新的防控措施。
【關(guān)鍵詞】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒 NSP2 原核表達(dá) 多抗血清 重組分析
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要10-12
• 英文摘要12-14
• 1 前言14-23
• 1.1 PRRS概述14
• 1.2 PRRSV病原學(xué)14
• 1.3 PRRSV分子生物學(xué)特性14-17
• 1.3.1 PRRSV基因組結(jié)構(gòu)14-15
• 1.3.2 PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白15
• 1.3.3 PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白15-17
• 1.4 PRRSV NSP2研究進(jìn)展17-21
• 1.4.1 NSP2結(jié)構(gòu)和功能17-18
• 1.4.2 NSP2的變異18-19
• 1.4.3 NSP2與PRRSV毒力19-20
• 1.4.4 NSP2與免疫20-21
• 1.4.5 NSP2與疫苗21
• 1.5 研究目的與意義21-23
• 2 材料與方法23-41
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-26
• 2.1.1 病料23
• 2.1.2 病毒、菌株與載體23
• 2.1.3 細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物23
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)藥品、試劑及標(biāo)準(zhǔn)參照物23-24
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)試劑的配制24-25
• 2.1.6 主要儀器和設(shè)備25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-41
• 2.2.1 PRRSV分離和培養(yǎng)26
• 2.2.2 PRRSV IFA鑒定26-27
• 2.2.3 引物設(shè)計(jì)27
• 2.2.4 PRRSV總RNA的提取27-28
• 2.2.5 NSP2基因RT-PCR28-29
• 2.2.6 NSP2 PCR產(chǎn)物的純化29
• 2.2.7 NSP2基因的克隆和鑒定29-31
• 2.2.8 NSP2序列遺傳進(jìn)化分析31-33
• 2.2.9 NSP2重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建33
• 2.2.10 NSP2重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定33-34
• 2.2.11 NSP2重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)34-35
• 2.2.12 重組蛋白純化、復(fù)性與活性鑒定35-36
• 2.2.13 抗NSP2多克隆抗體的制備36
• 2.2.14 抗NSP2多克隆抗體的生物學(xué)活性檢測(cè)36-37
• 2.2.15 Real-time PCR檢測(cè)抗NSP2多抗對(duì)PRRSV抑制作用37-39
• 2.2.16 美洲型PRRSV NSP2基因重組分析39-41
• 3 結(jié)果與分析41-69
• 3.1 PRRSV分離和培養(yǎng)41-42
• 3.2 PRRSV IFA檢測(cè)42-43
• 3.3 NSP2基因RT-PCR擴(kuò)增和鑒定43
• 3.4 NSP2基因的克隆和鑒定43-45
• 3.4.1 重組克隆質(zhì)粒PCR鑒定43-44
• 3.4.2 測(cè)序及序列比對(duì)44-45
• 3.5 NSP2遺傳進(jìn)化分析45-47
• 3.6 NSP2重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定47-49
• 3.6.1 重組原核表達(dá)質(zhì)粒鑒定47-48
• 3.6.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒鑒定48-49
• 3.7 NSP2重組蛋白表達(dá)49-50
• 3.8 NSP2重組蛋白純化和活性鑒定50-51
• 3.9 抗NSP2多克隆抗體生物學(xué)活性檢測(cè)51-55
• 3.9.1 間接ELISA檢測(cè)多抗效價(jià)51-52
• 3.9.2 Western-blot檢測(cè)52-53
• 3.9.3 多抗對(duì)細(xì)胞感染PRRSV的IFA檢測(cè)53-54
• 3.9.4 多抗對(duì)細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)NSP2蛋白IFA檢測(cè)54-55
• 3.10 Real-time PCR檢測(cè)抗nps2多抗對(duì)PRRSV抑制作用55-56
• 3.10.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒與實(shí)時(shí)引物的PCR鑒定55
• 3.10.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線55-56
• 3.10.3 多抗對(duì)PRRSV抑制效果56
• 3.11 美洲型PRRSV NSP2基因重組分析56-69
• 3.11.1 RDP4.2 軟件對(duì)PRRSV NSP2重組事件檢測(cè)結(jié)果56-57
• 3.11.2 SIMPLOT軟件對(duì)重組毒株NSP2遺傳相似性分析結(jié)果57-63
• 3.11.3 重組毒株NSP2遺傳進(jìn)化分析結(jié)果63-69
• 4 討論69-73
• 4.1 PRRSV分離、培養(yǎng)和鑒定69
• 4.2 NSP2的克隆和序列分析69-70
• 4.3 NSP2的原核表達(dá)及抗血清制備70-71
• 4.4 美洲型PRRSV NSP2重組分析71-73
• 5 結(jié)論73-74
• 致謝74-75
• 參考文獻(xiàn)75-85
• 附錄85-89
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文89

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  本文關(guān)鍵詞：高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP2抗體制備與重組分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：484490