本文關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的2mG_2-epsps基因轉(zhuǎn)化玉米幼胚的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：作為世界上的第二大玉米生產(chǎn)國(guó),我國(guó)玉米的種植面積和產(chǎn)量不斷增加,目前已超過(guò)水稻成為中國(guó)的第一大糧食作物。中國(guó)玉米生產(chǎn)長(zhǎng)期處于自給自足的平衡狀態(tài),2010年、2012年中國(guó)先后成為玉米凈進(jìn)口國(guó),我國(guó)在玉米進(jìn)出口關(guān)系上的轉(zhuǎn)變,使提高國(guó)內(nèi)玉米產(chǎn)量的任務(wù)更加緊迫。玉米生長(zhǎng)處于高溫、高濕季節(jié),雜草危害嚴(yán)重,化學(xué)除草是消除雜草危害、保證玉米增產(chǎn)增收的重要除草方式。草甘膦作為目前使用范圍最廣的滅生性除草劑,在殺死雜草的同時(shí),對(duì)農(nóng)作物同樣具有殺死作用。通過(guò)植物基因工程育種使玉米獲得草甘膦抗性,是解決這一矛盾的有效手段。本研究通過(guò)酶切連接法改造植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-epsps,使抗草甘膦基因2mG2-epsps處于玉米泛素蛋白啟動(dòng)子之后,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米自交系18-599R及Hi-II幼胚,并對(duì)幼胚轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化,獲得了T0代轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)和測(cè)序驗(yàn)證,表明目的基因2mG2-epsps已整合到玉米基因組中。主要結(jié)果如下：1、植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-epsps的改造。將pCAMBIA3301上草甘膦基因2mG2-epsps前的CaMV35S啟動(dòng)子換成玉米泛素蛋白啟動(dòng)子Ubiquitin啟動(dòng)子。作為玉米自身基因的啟動(dòng)子,用它驅(qū)動(dòng)外源基因轉(zhuǎn)化玉米時(shí),可以降低外源基因在轉(zhuǎn)基因個(gè)體中的拷貝數(shù),從而避免基因沉默現(xiàn)象的發(fā)生。2、玉米幼胚作為遺傳轉(zhuǎn)化的外植體,通過(guò)影響出愈率來(lái)影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)化效率。本研究用0.8-2.0 mm大小的幼胚,在菌液濃度為OD600=0.4-0.6,浸染時(shí)間為10 min的條件下進(jìn)行處理,恢復(fù)培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)出愈率。結(jié)果顯示,0.8-1.2 mm、1.2-1.5 mm、1.5-2.0 mm時(shí)的出愈率分別為93%、74%、38%,證明幼胚的大小為0.8-1.5 mm時(shí)均可以作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米遺傳轉(zhuǎn)化的受體。3、浸染后在恢復(fù)培養(yǎng)基中使用400mg/L的頭孢來(lái)抑制農(nóng)桿菌的繼續(xù)生長(zhǎng),為保證抗性愈傷組織的形成,篩選培養(yǎng)基中同樣需要添加頭孢。實(shí)驗(yàn)中用200 mg/L、400mg/L、600mg/L的頭孢進(jìn)行處理,在1.2mmol/L草甘膦篩選培養(yǎng)基中篩選15天后統(tǒng)計(jì)抗性愈傷率,結(jié)果表明篩選培養(yǎng)基中仍使用400 mg/L的頭孢才能保證較高的抗性愈傷率。4、菌液濃度、浸染時(shí)間及二者的交互作用均對(duì)浸染效率影響顯著,按照兩因素三水平設(shè)計(jì)9個(gè)處理,三次重復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,菌液濃度OD600=0.6,浸染時(shí)間為10 min時(shí),1.5 mmol/L草甘膦篩選15天后的平均抗性愈傷率最高,為37.33%。菌液濃度為OD600=0.4時(shí),可適當(dāng)延長(zhǎng)浸染時(shí)間來(lái)提高浸染效率。5、對(duì)18-599R和Hi-II幼胚的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hi-II比18-599R更早形成愈傷,且愈傷組織增長(zhǎng)速度更快,對(duì)草丁膦的篩選也更快作出反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中獲得78株18-599R再生植株,9株P(guān)CR檢查呈陽(yáng)性,陽(yáng)性率為11.5%；獲得18株Hi-II再生植株,5株P(guān)CR檢查呈陽(yáng)性,陽(yáng)性率為27.8%。所以,Hi-II比18-599R更適合作為玉米遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料,但授粉困難。選擇合適的栽種條件,保證Hi-II幼胚的穩(wěn)定供給,是其作為玉米遺傳轉(zhuǎn)化受體先決條件。6、轉(zhuǎn)基因再生植株畸形現(xiàn)象嚴(yán)重,從實(shí)驗(yàn)室到大田條件變化大,植株長(zhǎng)勢(shì)弱,雌雄穗花期不協(xié)調(diào),造成授粉困難,難以獲得可育后代。實(shí)際中可通過(guò)姊妹雜交,或與親本雜交來(lái)獲得T1代種子。
【關(guān)鍵詞】：18-599R Hi-Ⅱ 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 2mG_2-epsps基因 ubiquitin啟動(dòng)子
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S513
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 文獻(xiàn)綜述10-20
• 1.1 草甘膦11-12
• 1.1.1 草甘膦的除草機(jī)制11-12
• 1.1.2 生物對(duì)草甘膦的抗性12
• 1.2 轉(zhuǎn)基因玉米研究進(jìn)展12-14
• 1.2.1 轉(zhuǎn)基因玉米研究進(jìn)展13
• 1.2.2 抗草甘膦玉米研究進(jìn)展13-14
• 1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化14-18
• 1.3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法原理15
• 1.3.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的影響因素15-18
• 1.4 啟動(dòng)子18-19
• 1.5 研究目的意義19-20
• 2 材料與方法20-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 2.1.1 玉米材料20
• 2.1.2 菌株、質(zhì)粒20
• 2.1.3 儀器、試劑20
• 2.1.4 母液配制20-22
• 2.1.5 培養(yǎng)基22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-31
• 2.2.1 pCAMBIA3301-epsps植物表達(dá)載體的改造22-26
• 2.2.2 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌26-27
• 2.2.3 農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)化玉米幼胚27-30
• 2.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)30-31
• 3 結(jié)果與分析31-43
• 3.1 植物表達(dá)載體的改造31-34
• 3.1.1 ubiquitin啟動(dòng)子的獲得31-32
• 3.1.2 pCAMBIA3301-epsps表達(dá)載體改造32-34
• 3.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米遺傳轉(zhuǎn)化34-41
• 3.2.1 幼胚大小對(duì)出愈率的影響35-36
• 3.2.2 篩選時(shí)頭孢濃度的選擇36-37
• 3.2.3 浸染濃度和浸染時(shí)間的確定37-39
• 3.2.4 18-599R與Hi-ll轉(zhuǎn)化率比較39-41
• 3.3 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)41-43
• 3.3.1 T0代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)41-42
• 3.3.2 轉(zhuǎn)基因植株的測(cè)序驗(yàn)證42-43
• 3.4 轉(zhuǎn)基因畸形苗43
• 4 討論43-48
• 4.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建43-44
• 4.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化44-46
• 4.2.1 基因型的影響44-45
• 4.2.2 幼胚大小的影響45
• 4.2.3 菌液濃度和浸染時(shí)間的影響45-46
• 4.2.4 篩選時(shí)頭孢濃度的使用46
• 4.3 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)46-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 致謝52

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本文編號(hào)：433903