本文關(guān)鍵詞：日本結(jié)縷草ZjDREB2.2基因克隆及功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：結(jié)縷草(ZoysiaWilld.)是一類多年生禾本科植物,具有發(fā)達的匍匐莖和根狀莖,因具有抗干旱、耐踐踏、抗鹽堿、抗病蟲害能力強等特點,所以成為我國主要的建坪草種之一。目前關(guān)于結(jié)縷草結(jié)縷草抗逆分子機制研究尚不深入。研究結(jié)縷草對逆境脅迫的分子響應(yīng)特征,對結(jié)縷草的種植管理和育種研究有指導(dǎo)作用。已有研究表明DREB家族轉(zhuǎn)錄因子參與植物抗逆基因表達的調(diào)控,在植物逆境響應(yīng)中起關(guān)鍵作用。本研究以日本結(jié)縷草'Meyer'為材料,獲得了ZjDREB2.2的基因,是DREB類A-2家族成員,對其表達模式和基因功能進行了初步研究,結(jié)果如下：1. ZjDREB2.2有兩個轉(zhuǎn)錄本,分別命名為ZjDREB2.2-S和ZjDREB2.2-L。ZjDREB2.2-L基因含有一個50bp的插入序列,導(dǎo)致了閱讀框提前終止。ZjDREB2.2-S有完整的閱讀框,推測編碼338個氨基酸,編碼的蛋白質(zhì)分子量(MW)37297.6,等電點pI為4.86,第89-145位氨基酸構(gòu)成一個典型的AP2結(jié)構(gòu)域。ZjDREB2.2-S編碼的蛋白屬于DREB2組,與禾本科C4植物中的高粱、谷子的同源基因遺傳距離較近。2.在正常生長條件下,結(jié)縷草葉中ZjDREB2.2-S、ZjDREB2.2-L均有表達,受12℃以下低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達,而對干旱和高鹽脅迫響應(yīng)不顯著。在4℃低溫下脅迫72h期間,根和匍匐莖中的ZjDREB2.2-S均上調(diào)表達。葉和匍匐莖中ZjDREB2.2-L的表達也受低溫誘導(dǎo),但在根中的表達受低溫抑制。3.在酵母細胞中,GAL4BD-ZjDREB2.2-S融合基因可以與DRE元件特異結(jié)合并調(diào)節(jié)報告基因HIS3和LacZ基因的表達；GAL4BD-ZjDREB2.2-S融合基因表現(xiàn)出很強的轉(zhuǎn)錄激活活性。ZjDREB2.2-L沒有這些活性。4.構(gòu)建了35S啟動子調(diào)控的ZjDREB2.2基因表達載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥。通過PCR篩選得到17株轉(zhuǎn)化了ZjDREB2.2-S和1株轉(zhuǎn)化了ZjDREB2.2-L的植株。轉(zhuǎn)化ZjDREB2.2-S的植株具有矮化、生長緩慢和花期推遲的表型,而轉(zhuǎn)化ZjDREB2.2-L植株生長表型與對照植株無明顯差異。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)縷草 DREB 逆境響應(yīng)模式 酵母單雜交 轉(zhuǎn)基因
【學(xué)位授予單位】：中央民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S688.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 文獻綜述10-19
• 1. 結(jié)縷草屬植物抗逆研究進展10-14
• 1.1 結(jié)縷草形態(tài)特征和地理分布10-11
• 1.2 結(jié)縷草的抗寒性11-12
• 1.3 結(jié)縷草的耐鹽性12-13
• 1.4 結(jié)縷草的耐旱性13-14
• 1.5 結(jié)縷草抗逆育種研究14
• 2. 植物轉(zhuǎn)錄因子DREB研究14-17
• 2.1 DREB轉(zhuǎn)錄因子分子特征15-16
• 2.2 DREB的基因結(jié)構(gòu)同源性及多樣性16
• 2.3 DREB與植物抗逆育種16-17
• 3. 本研究思路、目的及意義17-19
• 第二章 日本結(jié)縷草ZjDREB2.2基因克隆及序列分析19-34
• 1、材料與方法19-26
• 1.1 植物材料、試劑及儀器19-21
• 1.1.1 植物材料培養(yǎng)及低溫處理方法19-20
• 1.1.2 試劑及引物20
• 1.1.3 儀器20-21
• 1.2 總RNA提取21-22
• 1.3 cDNA的制備22-23
• 1.4 ZjDREB2.2基因克隆23-25
• 1.4.1 ZjDREB2.2的PCR擴增23-24
• 1.4.2 ZjDREB2.2基因與T載體連接24-25
• 1.5 ZjDREB2.2基因的生物信息學(xué)分析25-26
• 2、結(jié)果與分析26-33
• 2.1 RNA提取效果26-27
• 2.2 cDNA的制備效果27-28
• 2.3 DREB2.2的PCR擴增28
• 2.4 ZjDREB2.2基因的生物信息學(xué)分析28-33
• 3、討論33-34
• 第三章 結(jié)縷草ZjDREB2.2基因表達的逆境響應(yīng)模式34-42
• 1 、材料與方法34-36
• 1.1 試劑及儀器34-35
• 1.1.1 試劑及引物34-35
• 1.1.2 植物材料培養(yǎng)及逆境處理方法35
• 1.2 總RNA提取和cDNA的制備35
• 1.3 cDNA的制備35-36
• 1.4 ZjDREB2.2基因的半定量RT-PCR36
• 2、結(jié)果與分析36-40
• 2.1 樣品RNA提取36-37
• 2.2 cDNA的檢驗與模板上樣量的確定37-38
• 2.3 不同逆境脅迫下ZjDREB2.2的表達情況38-40
• 2.3.2 不同溫度條件下ZjDREB2.2的表達情況39
• 2.3.3 低溫脅迫下匍匐莖和根組織中ZjDREB2.2的表達情況39-40
• 3、討論40-42
• 第四章 日本結(jié)縷草ZjDREB2.2基因轉(zhuǎn)錄因子的活性鑒定42-56
• 1、材料與方法42-49
• 1.1 實驗材料、試劑42-43
• 1.2 酵母表達載體構(gòu)建43-47
• 1.2.1 帶有attB位點的ZjDREB2.2核酸片段PCR擴增43-44
• 1.2.2 入門載體構(gòu)建44-45
• 1.2.3 目標(biāo)載體構(gòu)建45-47
• 1.3 酵母感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化47
• 1.4 ZjDREB2.2轉(zhuǎn)錄激活功能檢測47-48
• 1.5 ZjDREB2.2基因DNA結(jié)合功能檢測48-49
• 2、結(jié)果與分析49-54
• 2.1 帶attB位點的ZjDREB2.2基因片段PCR擴增49
• 2.2 pDonr221-ZjDREB22重組載體構(gòu)建49-50
• 2.3 含融合基因AD-ZjDREB2.2和BD-ZjDREB2.2載體構(gòu)建50-51
• 2.4 ZjDREB2.2基因轉(zhuǎn)錄激活功能鑒定51-52
• 2.5 ZjDREB2.2基因DRE結(jié)合功能鑒定52-54
• 3、討論54-56
• 第五章 日本結(jié)縷草ZjDREB2.2基因表達載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化56-65
• 1、材料與方法56-60
• 1.1 植物材料及菌株56
• 1.2 試劑及引物56-57
• 1.3 ZjDREB2.2基因植物表達載體的構(gòu)建57-58
• 1.4 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化58
• 1.5 蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥58-59
• 1.6 擬南芥抗性植株的篩選及PCR鑒定59-60
• 2、結(jié)果與分析60-63
• 2.1 植物表達載體pZP212-ZjDREB2.2的構(gòu)建60-61
• 2.2 抗性植株篩選和PCR鑒定61-63
• 2.3 轉(zhuǎn)基因植株的表型特征63
• 3、討論63-65
• 第六章 全文總結(jié)及研究展望65-66
• 參考文獻66-72
• 致謝72-74
• 縮略詞74-75
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄75

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