本文關(guān)鍵詞：蝦夷扇貝NF-κB家族基因和Tollip基因鑒定及表達分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)自1982年從日本引進以后,大大推動了中國北方養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,已經(jīng)成為我國重要的養(yǎng)殖貝類之一。近幾年來,由于大規(guī)模細菌性疾病的爆發(fā),扇貝死亡率逐年升高,導(dǎo)致了大量的經(jīng)濟損失。為了給扇貝養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供幫助,其重要潛在抗病基因和抗逆基因的鑒定顯得愈發(fā)重要。固有免疫系統(tǒng)是大多數(shù)物種應(yīng)對各種感染時所采取基本防御策略中的第一道防線,在物種生存和生命延續(xù)中起著至關(guān)重要的作用。作為免疫防御機制啟動的關(guān)鍵步驟,能夠激活下游免疫相關(guān)基因的TLR信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)自然成為了一個研究熱點。1.蝦夷扇貝NF-kB家族基因鑒定及表達分析NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)家族基因進化保守并參與多種生理學(xué)過程,在脊椎動物和無脊椎動物中得到了廣泛的研究。然而,其在雙殼類動物中并沒有進行系統(tǒng)的鑒定。本論文從蝦夷扇貝中鑒定出了兩個NF-κB家族基因：PyNF-κB和PyRel。PyNF-KB基因由長度為54bp至774bp的21個外顯子組成,其開放讀碼框(open reading frame)為3465bp,編碼1154個氨基酸；PyRel基因由長度為72bp至660bp的12個外顯子組成,其開放讀碼框為1920bp,編碼639個氨基酸。蛋白結(jié)構(gòu)分析和系統(tǒng)發(fā)生分析用來證實其身份和進化地位。PyNF-KB蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)擁有43個α螺旋、76個β折疊片、94個卷曲螺旋和90個轉(zhuǎn)角；PyRel蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)擁有16個α螺旋、41個β折疊片、56個卷曲螺旋和54個轉(zhuǎn)角。PyNF-KB和PyRel與其它軟體動物Rel/NF-KB蛋白擁有較高的相似度,包括進化保守的1個RHD功能域(Relhomology domain)和1個IPT功能域(Ig-like, plexins, transcription factor domain),還有兩個保守的模塊。此外,PyNF-KB擁有1個DEATH功能域(death domain)和6個ANK功能域(ankyrin domain),但TAD功能域(transcription activation domain)并沒有在PyRel蛋白中預(yù)測到。所有Rel/NF-KB蛋白分成兩大進化支,相較于脊椎動物Rel/NF-KB而言,PyNF-KB和PyRel在結(jié)構(gòu)上進化保守,但和其它無脊椎動物一樣沒有旁系同源。為了進一步探索蝦夷扇貝NF-κB家族基因的作用,利用Real-time qRT-PCR對蝦夷扇貝在不同發(fā)育時期、健康成體組織和受到藤黃微球菌、鰻弧菌侵染后不同時間點(3,6,12和24h)血細胞的表達模式進行了分析。結(jié)果表明,PyNF-KB前四個時期的表達水平顯著高于其它時期,包括卵母細胞、受精卵、多細胞期、囊胚期；PyRel則在原腸胚期、擔輪幼蟲期和D型幼蟲期的表達水平較高。在成體組織中,PyNF-KB和PyRel普遍表達,并在免疫相關(guān)組織中高表達。受到藤黃微球菌和鰻弧菌侵染后,PyNF-KB和PyRel在3h時都顯著上升,PyNF-KB更加劇烈的波動變化暗示了在對抗革蘭氏陰性細菌侵染時,蝦夷扇貝可能存在IMD補償信號通路(immune deficiency signaling pathway)。這個復(fù)雜的表達模式表明了PyNF-KB和PyRel在免疫響應(yīng)中具有特異和協(xié)同作用。2.蝦夷扇貝Tollip基因鑒定及表達分析Tollip (Toll-interacting protein)是TLR介導(dǎo)固有免疫反應(yīng)中的一個關(guān)鍵調(diào)控因子,但其在貝類動物中并沒有進行系統(tǒng)的鑒定。本論文鑒定了PyTollip,并進行了蛋白結(jié)構(gòu)分析和系統(tǒng)發(fā)生分析。PyTollip基因由6個內(nèi)含子和7個外顯子組成；其cDNA全長為3815bp,擁有一個73bp的5'UTR, 一個2875bp的3’UTR和一個867bp編碼288個氨基酸的開放讀碼框。其蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)擁有11個α螺旋、20個β折疊片、30個卷曲螺旋和27個轉(zhuǎn)角。根據(jù)蛋白多序列比對結(jié)果,PyTollip與人、鼠和紫貽貝的一致性分別為50%、49%和64%。相較于其它脊椎動物和無脊椎動物Tollip而言,除了在C2功能域(central conserved 2 domain)中發(fā)現(xiàn)了一個明顯的殘基替換(N150), PyTollip在序列和結(jié)構(gòu)特征上都高度保守,其65-162位氨基酸區(qū)域為C2功能域,244-286位氨基酸區(qū)域為CUE功能域(coupling of ubiquitin to endoplasmic reticulum degradation domain)。對PyTollip的表達分析是在蝦夷扇貝的不同發(fā)育時期、健康成體組織和受到藤黃微球菌、鰻弧菌侵染后不同時間點(3,6,12和24h)的血細胞中進行的。Real-time qRT-PCR結(jié)果表明,受到藤黃微球菌和鰻弧菌侵染后,PyTollip在3h時都顯著上升。而受到鰻弧菌侵染24h時,PyTollip的表達量又出現(xiàn)了一個顯著的升高。這一現(xiàn)象為Tollip和TLR信號通路在扇貝受到不同細菌病原體侵染后的免疫響應(yīng)機制提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：蝦夷扇貝 Rel/NF-κB Tollip 固有免疫 陽性細菌和陰性細菌刺激 TLR信號通路 IMD信號通路
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-8
• abstract8-14
• 英文縮寫表14-16
• 第一章 文獻綜述16-27
• 第一節(jié) 固有免疫系統(tǒng)16-17
• 第二節(jié) TLR通路17-21
• 1. MyD88依賴型TLR通路19-20
• 2. TIRF依賴型TLR通路20
• 3. 果蠅Toll通路20-21
• 第三節(jié) NF-κB家族基因研究進展21-23
• 第四節(jié) Tollip基因研究進展23-25
• 第五節(jié) 蝦夷扇貝及其病害25-27
• 第二章 蝦夷扇貝NF-κB家族基因鑒定及表達分析27-50
• 第一節(jié) NF-κB家族基因鑒定及序列分析27-38
• 1. 分析方法27-29
• 2. 結(jié)果29-38
• 2.1 NF-κB家族基因序列分析29-34
• 2.2 NF-κB家族基因系統(tǒng)發(fā)生分析34-38
• 3. 討論38
• 第二節(jié) NF-κB家族基因時空表達分析38-46
• 1. 實驗材料38-40
• 1.1 扇貝材料39
• 1.2 主要儀器和藥品39-40
• 2. 實驗方法40-44
• 2.1 提取總RNA40-41
• 2.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA41-42
• 2.3 確定最佳退火溫度42
• 2.4 Real-time qRT-PCR42-43
• 2.5 數(shù)據(jù)分析43-44
• 3. 結(jié)果44-45
• 4. 討論45-46
• 第三節(jié) NF-κB家族基因細菌侵染后的表達分析46-50
• 1. 實驗材料46
• 1.1 扇貝材料46
• 1.2 主要儀器和藥品46
• 2. 實驗方法46-47
• 3. 結(jié)果47-48
• 4. 討論48-50
• 第三章 蝦夷扇貝Tollip基因鑒定及表達分析50-62
• 第一節(jié) Tollip基因鑒定、克隆及序列分析50-57
• 1. 分析方法50
• 2. 實驗材料50
• 3. 實驗方法50-53
• 3.1 提取總RNA50
• 3.2 構(gòu)建5’、3’-RACE-Ready cDNA文庫50-51
• 3.3 獲得cDNA全長51-53
• 4. 結(jié)果53-56
• 4.1 Tollip基因序列分析53-54
• 4.2 Tollip基因系統(tǒng)發(fā)生分析54-56
• 5. 討論56-57
• 第二節(jié) Tollip基因時空表達分析57-59
• 1. 實驗材料57
• 2. 實驗方法57
• 3. 結(jié)果57-58
• 4. 討論58-59
• 第三節(jié) Tollip基因細菌侵染后的表達分析59-62
• 1. 實驗材料59
• 1.1 扇貝材料59
• 1.2 主要儀器和藥品59
• 2. 實驗方法59
• 3. 結(jié)果59-60
• 4. 討論60-62
• 參考文獻62-71
• 致謝71-72
• 個人簡歷72
• 學(xué)術(shù)成果72

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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  本文關(guān)鍵詞：蝦夷扇貝NF-κB家族基因和Tollip基因鑒定及表達分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：424832