本文關(guān)鍵詞：表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒gI和gB基因的重組新城疫病毒的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：雞傳染性喉氣管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是由雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)引起的雞的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病,是影響世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。目前主要使用修飾過的ILTV活病毒疫苗、以火雞皰疹病毒(Turkey herpesvirus,HVT)和以痘病毒(Fowlpox virus,FPV)為載體的載體疫苗來預(yù)防ILT。然而,ILTV活病毒疫苗在機(jī)體傳代的過程中可能發(fā)生毒力返強(qiáng),并且導(dǎo)致潛伏感染,而HVT和FPV的活載體疫苗免疫保護(hù)效果不如弱毒疫苗有效,因此有必要研發(fā)更加有效的疫苗來預(yù)防ILT。ILTV基因組為線性雙鏈DNA,大小在150 kb左右,含有76個開放閱讀框(Open reading frame,ORF),編碼至少11種囊膜糖蛋白,UL27和US7分別編碼病毒的糖蛋白gB和gI。gI和gE形成異源二聚體,促進(jìn)病毒在細(xì)胞間的擴(kuò)散。gB是病毒感染所必須的,參與膜融合、病毒入侵過程。新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的危害養(yǎng)禽業(yè)的重大烈性傳染病。NDV基因組是不分節(jié)段、單股、負(fù)鏈RNA,編碼8種蛋白。根據(jù)其致病性將NDV分為弱毒株、中等毒力毒株和強(qiáng)毒株。目前,新城疫弱毒株,如La Sota毒株,被廣泛用作疫苗來預(yù)防NDV,而且弱毒株作為活病毒載體,通過反向遺傳操作系統(tǒng),常用于表達(dá)人類和動物其他病毒的外源基因,研制重組病毒作為疫苗或其他生物制品。ILTV LJS09株是從中國江蘇省某養(yǎng)殖場分離到的一株強(qiáng)毒株,其全基因組已經(jīng)被測序。本研究根據(jù)GenBank上登錄的ILTV LJS09株全基因組(登錄號:JX458822)序列,將gB基因分為前后部分重疊的2段,分別設(shè)計擴(kuò)增引物,同時設(shè)計擴(kuò)增gI全長的引物,通過基因克隆技術(shù),將3個基因片段克隆于表達(dá)載體PCAGGS中,首先通過酶切分析及序列測定,驗證其編碼框是否正確,然后將該重組載體進(jìn)一步用于感染性克隆載體的構(gòu)建及重組病毒的拯救。本研究用的NDV基因組全長cDNA克隆以pBR322為骨架載體,通過克隆La Sota毒株基因組構(gòu)建,在NDV cDNA的P和M之間,即基因組的3 165 bp位置有引入Pme I酶切位點,外源基因克隆到此位置。本研究拯救了表達(dá)ILTV LJS09株的gI、兩個gB基因片段的重組新城疫病毒,分別命名為r La-gI,r La-gBN,r La-gBC。對三個重組病毒救獲后進(jìn)行RT-PCR、間接免疫熒光(IFA)、蛋白免疫印跡(Western Blot),評價重組病毒的遺傳穩(wěn)定性、外源蛋白表達(dá)穩(wěn)定性,結(jié)果表明三個外源蛋白基因可穩(wěn)定存在至少二十代,而且都在重組病毒感染的細(xì)胞中得到有效表達(dá)。通過測定和比較重組病毒與野毒株La Sota的HA、EID50、MDT,表明重組病毒保持了La Sota疫苗株高滴度的雞胚生長特及病毒的低致病性。此外,重組病毒的生長動力學(xué)曲線與疫苗株相似,在感染后72 h時病毒滴度達(dá)到最大。動物免疫攻毒實驗表明,三個重組病毒免疫機(jī)體后,均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對NDV的高水平的抗體,但用ELISA檢測不到針對ILTV的抗體;NDV強(qiáng)毒株F48E9攻毒后,免疫組可被完全保護(hù),對照組全部死亡,排毒率明顯低于對照組,表明重組病毒的免疫對新城疫強(qiáng)毒的攻擊具有良好的保護(hù)作用;ILTV強(qiáng)毒株WG攻毒后,三個重組病毒免疫組在發(fā)病率、死亡率以及排毒率方面與對照組均沒有明顯的差異。重組病毒rLa-gBN,r La-gBC不能提供保護(hù)效果,推測可能是由于外源蛋白表達(dá)太少且外源蛋白沒有組裝進(jìn)病毒粒子等原因引起,具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：新城疫病毒 反向遺傳操作 雞傳染性喉氣管炎病毒 gI gB
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 英文縮略表11-12
• 1 引言12-18
• 1.1 傳染性喉氣管炎病毒分子生物學(xué)及其疫苗研究進(jìn)展12-15
• 1.1.1 ILTV基因組結(jié)構(gòu)及特性12-13
• 1.1.2 ILTV結(jié)構(gòu)蛋白與生物學(xué)功能13-14
• 1.1.3 ILTV疫苗研究進(jìn)展14-15
• 1.2 新城疫病毒及作為病毒載體的應(yīng)用15-17
• 1.2.1 新城疫病毒分子生物學(xué)特性15-16
• 1.2.2 新城疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的應(yīng)用16-17
• 1.3 研究的目的和意義17-18
• 2 材料和方法18-30
• 2.1 材料18-20
• 2.1.1 細(xì)胞、病毒株、質(zhì)粒、SPF雞胚及SPF雞18
• 2.1.2 主要試劑18
• 2.1.3 主要儀器18
• 2.1.4 主要試劑配置18-19
• 2.1.5 引物設(shè)計19-20
• 2.2 方法20-30
• 2.2.1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定20-22
• 2.2.2 間接免疫熒光鑒定目的基因在真核表達(dá)載體中表達(dá)22-23
• 2.2.3 重組病毒基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建及鑒定23-25
• 2.2.4 病毒拯救25-26
• 2.2.5 間接免疫熒光26
• 2.2.6 Western Blot26-27
• 2.2.7 重組病毒的致病性27
• 2.2.8 重組病毒的穩(wěn)定性27
• 2.2.9 重組病毒的雞胚生長特性27-28
• 2.2.10 重組病毒的免疫保護(hù)試驗28-30
• 3 結(jié)果30-44
• 3.1 重組病毒的拯救30-38
• 3.1.1 gI、gBN、gBC基因的擴(kuò)增及鑒定30-32
• 3.1.2 真核表達(dá)質(zhì)粒與重組病毒cDNA克隆的構(gòu)建及鑒定32-38
• 3.2 重組病毒的體外生物學(xué)特性38-42
• 3.2.1 重組病毒的雞胚內(nèi)生長特性38-40
• 3.2.2 重組病毒的穩(wěn)定性40-42
• 3.2.3 重組病毒的致病性42
• 3.3 重組病毒免疫效果評價42-44
• 3.3.1 重組病毒免疫后機(jī)體內(nèi)抗體效價變化42-43
• 3.3.2 攻毒后發(fā)病率、死亡率及排毒情況43-44
• 4 討論44-47
• 5 全文結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 致謝53-54
• 作者簡歷54

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 葛金英;溫志遠(yuǎn);王永;鮑恩東;步志高;;表達(dá)綠色熒光蛋白重組新城疫病毒LaSota疫苗株的構(gòu)建[J];微生物學(xué)報;2006年04期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 黃海瓊;表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因的重組馬立克病毒疫苗株的構(gòu)建[D];揚(yáng)州大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒gI和gB基因的重組新城疫病毒的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：418331