本文關鍵詞：基于龍眼轉(zhuǎn)錄組的SSR引物開發(fā)與應用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：以‘紅核子’龍眼EC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎進行EST-SSR分子標記研究,共計開發(fā)多態(tài)性引物11對,完成EST-SSR-PCR試驗體系的優(yōu)化,將所優(yōu)化的EST-SSR標記應用于龍眼的親緣關系分析,并與ISSR分子標記進行比較分析。具體研究結(jié)果如下：1龍眼EST-SSR位點特征分析以本實驗室已經(jīng)獲得的紅核子龍眼EC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為材料,經(jīng)MISA軟件的SSR位點檢索與分析,共檢索出5710個EST-SSR位點,且EST-SSR位點出現(xiàn)頻率為8.28%,位點間平均距離為5.41 kb,包含796種基元。從數(shù)量上分析,二核苷基元和三核苷基元所占比例最大,分別為43.35%和32.73%,二者共占總EST-SSR位點的76.08%,為優(yōu)勢核苷基元。從EST-SSR位點的基元種類來看,六核苷基元與五核苷基元的種類最多,分別為389種和244種,所占比例分別為48.87%和30.65%,二者占全部EST-SSR基元種類的79.52%。EST-SSR位點的檢索結(jié)果還表明,二核苷酸基元中,(AG)n=(TC)n和(CT)n=(GA)n所占比例分別為17.55%和15.17%,是優(yōu)勢重復類型；而(CG)n=(GC)n重復類型出現(xiàn)頻率最低,僅為0.00725%,表現(xiàn)出明顯的GC偏倚性；在三核苷基元中,(AGA)n=(TCT)n是最優(yōu)重復類型,占總EST-SSRs的比例為2.92%,其次為(CTT)n=(GAA)n、 (AAG)n=(TTC)n,所占比例分別為2.71%、2.59%。綜上,紅核子龍眼EC轉(zhuǎn)錄組序列中EST-SSR位點含量豐富。2龍眼EST-SSR-PCR體系的優(yōu)化通過L16(44)正交試驗,得到龍眼EST-SSR-PCR的最優(yōu)應體系為：DNA模板80 ng,0.15 mmol/L dNTPs 2μL,0.1 μmol/L上下游引物各1 μL, Tap酶1.5 U；非優(yōu)化試驗因素10×PCR Buffer (1.5mM Mg2+) 2.5 μL, ddH2O補足至25μL。分別隨機選取3對引物和8份龍眼種質(zhì)樣本的DNA作為模板對該優(yōu)化體系進行驗證,電泳結(jié)果顯示：擴增條帶清晰平整、無引物二聚體、無非特異擴增、背景干擾小,說明得到的優(yōu)化體系穩(wěn)定可靠。3龍眼EST-SSR多態(tài)性分析依據(jù)所分析的龍眼EST-SSR位點序列特征,使用Primer Premier 5軟件共設計50對長度在18-24 bp的引物,引物對的擴增片段長度為100-300 bp。再以‘立冬本’的DNA為模板,對所設計引物的可用性進行驗證,結(jié)果顯示50對引物中共有19對的擴增片段符合預期大小。進一步以95份供試龍眼種質(zhì)的DNA為模板進行PCR擴增,10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示,其中有11對引物擴增的多態(tài)性良好,主帶明亮清晰,無拖尾、無彌散、背景干擾小,多態(tài)性引物開發(fā)得率達22%。這11對引物在95份龍眼種質(zhì)中的擴增多態(tài)性表現(xiàn)為：共獲得114條譜帶,多態(tài)性位點比例達100%；多態(tài)性位點的數(shù)量分布范圍在5-25個,其中LY-43引物對所擴增的多態(tài)性位點數(shù)最多(共25個),LY-9引物對的多態(tài)性位點最少(僅5個)；平均每個龍眼EST-SSR標記能夠擴增10.36條多態(tài)性譜帶,說明基于紅核子龍眼EC轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的EST-SSR標記具有豐富多態(tài)性。4龍眼EST-SSR與ISSR的比較分析本試驗分別運用EST-SSR與ISSR對95份供試龍眼種質(zhì)進行了親緣關系研究。EST-SSR分子標記開發(fā)的11對引物對供試龍眼材料擴增譜帶的分布范圍為5-25條,分布范圍較廣,每對引物的平均多態(tài)位點為10.36個；ISSR分子標記所使用的10對UBC引物對供試龍眼材料擴增譜帶分布范圍8-12條,分布范圍較窄,每對引物的平均多態(tài)位點為9.50個；EST-SSR擴增的平均多態(tài)性位點比ISSR多。此外,電泳結(jié)果表明EST-SSR標記所開發(fā)的特異引物比ISSR分子標記通用UBC引物更能高效結(jié)合到樣本DNA；從開發(fā)所得的11對EST-SSR引物中獲得5對特異標記：LY-5、LY-38、LY-43、LY-45、LY-48,若加大龍眼EST-SSR特異標記引物的開發(fā)力度,將有利于龍眼種質(zhì)資源的鑒別�；贓ST-SSR標記的聚類結(jié)果顯示95份供試龍眼種質(zhì)能被有效區(qū)分,聚類結(jié)果為2大組、8類群。其中,‘荔枝龍眼’單獨聚為一組,表明其遺傳背景獨特,有別于其他龍眼種質(zhì)；‘荔枝龍眼’和‘荔龍’不是同一品種。一些地方品種如‘南安1號’和‘農(nóng)科所3號’被聚類在一起,表明其遺傳背景相似；供試的東壁龍眼種質(zhì)被聚類為不同的類群,說明不同東壁品種龍眼之間仍存在遺傳多態(tài)性；此外也揭示出個別品種如‘碼頭1號’與‘碼頭2號’存在遺傳差異。以上結(jié)論與ISSR標記的聚類結(jié)果契合,表明兩種分子標記能揭示出龍眼聚類的共性與差異性。綜合分析擴增效果及聚類結(jié)果,認為龍眼EST-SSR標記開發(fā)有效,能將其運用到龍眼親緣關系分析中。
【關鍵詞】：龍眼 轉(zhuǎn)錄組 SSR 引物開發(fā) 應用
【學位授予單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S667.2
【目錄】：

• 縮寫詞9-11
• 摘要11-13
• Abstract13-17
• 第一章 引言17-25
• 1 龍眼種質(zhì)資源概述17-18
• 2 分子標記在龍眼上的應用18-20
• 3 SSR分子標記技術20-22
• 3.1 SSR的定義及原理20
• 3.2 SSR分子標記的優(yōu)缺點20-21
• 3.3 SSR分子標記的分類21
• 3.4 SSR標記在植物上的應用21-22
• 3.4.1 構(gòu)建植物遺傳連鎖圖譜21
• 3.4.2 植物親緣關系及遺傳多樣性研究21-22
• 3.4.3 植物種質(zhì)資源的鑒定分析22
• 3.4.4 開發(fā)SSR標記的途徑22
• 4 本研究的目的意義及主要內(nèi)容22-25
• 4.1 本研究的目的意義22-23
• 4.2 本研究的主要內(nèi)容23-25
• 第二章 龍眼EST-SSR位點分析25-32
• 1 材料與方法25-26
• 1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及分析軟件25
• 1.2 方法25-26
• 1.2.1 龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)特征25
• 1.2.2 龍眼EST-SSR位點信息檢索25-26
• 2 結(jié)果與分析26-29
• 2.1 龍眼EST-SSR位點信息出現(xiàn)頻率及總體特征26
• 2.2 龍眼EST-SSR位點出現(xiàn)比例及長度特征26-27
• 2.3 龍眼EST-SSR位點優(yōu)勢基元出現(xiàn)頻率及比例27-29
• 3 討論29-32
• 3.1 龍眼EST-SSR位點含量豐富29-30
• 3.2 龍眼EST-SSR基元數(shù)量與種類豐富30-32
• 第三章 EST-SSR引物初篩與體系優(yōu)化32-41
• 1 材料與方法32-35
• 1.1 材料32
• 1.1.1 植物材料與分析軟件32
• 1.1.2 藥品耗材與儀器設備32
• 1.2 方法32-35
• 1.2.1 龍眼EST-SSR標記引物設計33
• 1.2.2 龍眼總DNA提取及檢測33-34
• 1.2.3 SSR-PCR反應預擴增及龍眼EST-SSR標記引物初步篩選34
• 1.2.4 龍眼SSR-PCR體系優(yōu)化34-35
• 1.2.5 SSR-PCR優(yōu)化體系驗證35
• 2 結(jié)果與分析35-39
• 2.1 龍眼EST-SSR引物初步篩選35-37
• 2.2 SSR-PCR體系L_(16)(4~4)正交實驗結(jié)果分析37-38
• 2.3 最優(yōu)SSR-PCR反應體系的驗證分析38-39
• 3 討論39-41
• 3.1 龍眼SSR-PCR優(yōu)化體系穩(wěn)定可靠39-40
• 3.2 龍眼EST-SSR標記引物多態(tài)性良好40-41
• 第四章 龍眼EST-SSR標記在親緣關系分析上的應用及其與ISSR的比較分析41-65
• 第一節(jié) 龍眼EST-SSR在親緣關系分析上的應用41-51
• 1 材料與方法41-44
• 1.1 材料41-42
• 1.1.1 植物材料與分析軟件42
• 1.1.2 藥品耗材與儀器設備42
• 1.2 方法42-44
• 1.2.1 龍眼總DNA提取及檢測42
• 1.2.2 多態(tài)性EST-SSR引物開發(fā)42
• 1.2.3 SSR-PCR體系與擴增程序42
• 1.2.4 SSR-PCR產(chǎn)物檢測42-43
• 1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析43-44
• 2 結(jié)果與分析44-50
• 2.1 龍眼材料總DNA檢測44
• 2.2 EST-SSR分子標記擴增結(jié)果分析44-47
• 2.3 EST-SSR分子標記引物多態(tài)性分析47
• 2.4 基于EST-SSR標記的聚類分析47-50
• 3 討論50-51
• 3.1 龍眼EST-SSR擴增譜帶多態(tài)性良好50
• 3.2 龍眼EST-SSR聚類能揭示品種差異50-51
• 第二節(jié) ISSR在龍眼親緣關系研究上的應用51-59
• 1 材料與方法52-53
• 1.1 材料52
• 1.1.1 植物材料與分析軟件52
• 1.1.2 藥品耗材與儀器設備52
• 1.2 方法52-53
• 1.2.1 龍眼總DNA提取及檢測52
• 1.2.2 ISSR引物選擇52-53
• 1.2.3 ISSR-PCR體系與擴增程序53
• 1.2.4 ISSR-PCR產(chǎn)物檢測53
• 1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析53
• 2 結(jié)果與分析53-59
• 2.1 龍眼材料總DNA檢測53-54
• 2.2 ISSR分子標記擴增結(jié)果分析54-56
• 2.3 ISSR分子標記引物多態(tài)性分析56
• 2.4 基于ISSR標記的聚類分析56-59
• 3 討論59
• 第三節(jié) 龍眼EST-SSR與ISSR的比較分析59-65
• 1 材料與方法60
• 1.1 植物材料與分析軟件60
• 1.2 方法60
• 1.2.1 電泳擴增效果比較60
• 1.2.2 聚類結(jié)果比較60
• 2 結(jié)果與分析60-62
• 2.1 EST-SSR與ISSR的擴增效果比較分析60-61
• 2.2 EST-SSR與ISSR的聚類結(jié)果比較分析61-62
• 3 討論62-65
• 3.1 龍眼EST-SSR的特異擴增效果優(yōu)于ISSR62-63
• 3.2 龍眼EST-SSR可用于龍眼親緣關系分析63-65
• 第五章 小結(jié)65-68
• 1 龍眼EST-SSR位點含量豐富65
• 2 龍眼EST-SSR-PCR體系的優(yōu)化65-66
• 3 龍眼EST-SSR標記具有豐富多態(tài)性66
• 4 龍眼EST-SSR標記與ISSR標記的比較分析66-68
• 參考文獻68-74
• 附錄Ⅰ 95份龍眼供試材料74-76
• 附錄Ⅱ 95份龍眼供試材料的DNA檢測結(jié)果76-77
• 附錄Ⅲ 各EST-SSR標記引物對95份龍眼供試材料的擴增結(jié)果77-83
• 附錄Ⅳ 各ISSR標記引物對95份龍眼供試材料的擴增結(jié)果83-93
• 致謝93

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本文編號：413504