本文關鍵詞：利用VIGS技術對草莓FaMYB5基因功能的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：病毒誘導基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)是植物抵抗病毒侵染的一種自然機制,屬于轉錄后水平的基因沉默現(xiàn)象。是目前開發(fā)的一種反向遺傳學新技術,在動植物功能基因組學研究方面得到廣泛應用。類黃酮化合物(Flavonids)是植物重要的次生代謝產(chǎn)物之一,在植物界中分布廣泛且具有較強的生物活性,不僅有益人類身體健康還影響植物花器官發(fā)育和果實著色等。草莓(Fragaria×ananassa. Duch.)屬薔薇科草莓屬多年生草本植物,其果實含高濃度的類黃酮化合物,具有重要的保健功能和顯著的經(jīng)濟效益,因此倍受消費者和種植者的喜愛。目前,草莓類黃酮化合物代謝途徑中主要結構基因已被認知,但是該途徑的轉錄調控信息卻知之甚少。大量研究表明,類黃酮化合物花青素苷、原花青素等代謝途徑均受MYB轉錄因子調控。因此利用VIGS技術快速鑒定黃酮化合物代謝相關轉錄因子的功能,揭示在轉錄水平上對草莓黃酮類物質代謝途徑的調控機理,對改善草莓的品質,以及其他園藝作物的遺傳改良,具有重要的理論和實際意義。本研究以草莓‘豐香’(Fragaria× ananassa cv. Toyonaka)為材料。利用VIGS技術對草莓果實中類黃酮化合物代謝相關轉錄因子FaMYB5基因進行沉默,并對該基因沉默后類黃酮化合物途徑相關基因表達量進行分析,同時對沉默后果實中花青素苷和原花青素的含量進行測定,以期全面探明草莓中FaMYB5基因對類黃酮化合物代謝途徑的調控作用及其機制,揭示其功能。主要得到以下研究結果：1采用改良的CTAB法提取草莓不同組織及果實不同發(fā)育時期的總RNA,并反轉錄成cDNA。根據(jù)GenBank中已登錄的森林草莓MYB5基因序列(JQ989280.1),同源克隆FaMYB5基因全長編碼序列(Full Coding Sequences, CDS);序列分析表明：該基因CDS區(qū)共832bp,編碼273個氨基酸,與森林草莓的MYB5同源性達97%。其蛋白結構中缺少R2結構域,因此FaMYB5轉錄因子更類似R3類MYB轉錄因子,并且其R3重復單元中存在與bHLH因子互作作用相關的[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R序列。2采用半定量RT-PCR和實時熒光定量PCR (qRT-PCR)技術檢測FaMYB5在果實不同發(fā)育時期的基因表達情況。研究結果表明：FaMYB5基因在草莓果實發(fā)育的6個時期均有表達,其表達量存在差異。從整體趨勢看,隨著果實發(fā)育成熟,FaMYB5基因的表達是逐漸上升的。在果實的小綠期(SG), FaMYB5基因的表達量最低。但是在白果期(Vhite)出現(xiàn)一個降低的峰值,其表達量略高于小綠期,之后草莓果實開始轉紅時其表達量又逐漸上升,在果實全紅期(FR)達到最大,說明FaMYB5與類黃酮化合物代謝有關。3構建VIGS載體pTRV-FaMYB5,通過注射法侵染草莓果實,導致果實內源FaMYB5基因沉默建立草莓VIGS體系。觀察FaMYB5沉默后‘豐香’草莓果實的表觀變化,采用半定量RT-PCR和qRT-PCR的方法檢測FaMYB5基因的沉默效率,結果顯示FaMYBS基因沉默效率達60%,成功構建了pTRV2-FaMYB5的VIGS重組載體及草莓VIGS體系。4采用半定量RT-PCR和qRT-PCR測定FaMYB5沉默后草莓類黃酮化合物代謝途徑相關基因的表達量,同時分別采用HPLC和DMACA化學反應法對FaMYB5沉默后果實中的花青素苷和原花青素進行測定。結果表明：該基因沉默后,FaANS的表達量及花青素苷含量降低,而FaLAR、FaANR和FaMYB9表達量均增加,從而導致果實中原花青素含量增加。綜合分析表明：FaMYB5是通過與FaMYB9轉錄因子競爭bHLH3蛋白結合的結合位點,從而抑制TTGI-FaMYB9-bHLH3三元復合體的活性,間接調控FaLAR/FaANR基因的表達。從分子和生理兩方面的研究表明：FaMYB5轉錄因子是草莓類黃酮化合物代謝途徑中的原花青素合成途徑中的負調控因子。5研究發(fā)現(xiàn)FaMYB5基因沉默后FabHLH3、bHLH3△基因的表達量減少,說明它們之間存在抑制關系。Burr認為由于FabHLH3△和FaMYB5有相互作用,兩者是否相互抑制還需進一步研究。另外FaMYB5基因沉默也引起了FaGL3基因表達量的增加,但aANS的表達量卻下降,這與Jan G. Schaart推斷的FaGL3轉錄因子可能促進FaANS的表達截然不同,所以FaGL3是否與FaTTG1和FaMYB 10結合形成MBW三元復合體,形成的三元符合體是否調節(jié)FaANS還需要進一步研究。
【關鍵詞】：VIGS 草莓 FaMYB5 類黃酮
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S668.4
【目錄】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 縮寫詞表12-13
• 第一章 課題提出與前人研究進展13-22
• 1 課題提出13-14
• 2 VIGS的研究進展14-18
• 2.1 VIGS的發(fā)現(xiàn)14
• 2.2 VIGS的作用機制14-16
• 2.2.1 起始階段14-15
• 2.2.2 維持階段15
• 2.2.3 信號放大與傳播15-16
• 2.3 VIGS載體16-17
• 2.4 VIGS在植物基因功能研究上的應用17-18
• 3 植物轉錄因子概念及分類18-20
• 3.1 MY-B轉錄因子的結構特征18-19
• 3.2 FaMYB5轉錄因子的發(fā)現(xiàn)19
• 3.3 FaMYB5的功能研究19-20
• 4 本課題的目標與意義20-22
• 第二章 草莓FAMYB5基因的克隆序列分析及表達22-36
• 1 材料與方法22-29
• 1.1 供試材料22-23
• 1.2 試劑和試劑盒23
• 1.3 工程菌株23
• 1.4 載體23-24
• 1.5 實驗方法24-29
• 1.5.1 總RNA提取及檢測24
• 1.5.2 cDNA合成24-25
• 1.5.3 引物的設計與片段擴增25-26
• 1.5.4 PCR產(chǎn)物回收26
• 1.5.5 感受態(tài)細胞制備26-27
• 1.5.6 產(chǎn)物與載體的連接、轉化及測序后數(shù)據(jù)分析27
• 1.5.7 半定量RT-PCR檢測基因表達水平27-28
• 1.5.8 qRT-PCR檢測基因表達水平28-29
• 2 結果與分析29-35
• 2.1 草莓6個不同發(fā)育時期總RNA的提取29-30
• 2.2 FaMYB5的全長編碼區(qū)擴增和基因序列分析30-31
• 2.3 FaMYB5轉錄因子的結構分析31-34
• 2.3.1 FaMYB5功能相近轉錄因子的系統(tǒng)發(fā)育分析33
• 2.3.2 FaMYB5的三級結構預測33-34
• 2.4 FaMYB5基因在草莓果實發(fā)育過程中的表達34-35
• 3 討論35-36
• 第三章 草莓果實VIGS體系的建立36-46
• 1 材料與試劑36-38
• 1.1 材料36
• 1.2 菌株與質粒36-37
• 1.3 酶及試劑37-38
• 2 方法38-42
• 2.1 FaMYB5基因特異性擴增及PCR產(chǎn)物回收38
• 2.2 酶切38
• 2.3 酶切產(chǎn)物及載體回收38-39
• 2.4 目的基因與載體連接39
• 2.5 大腸桿菌轉化39
• 2.6 質粒提取及鑒定39-40
• 2.7 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備40
• 2.8 轉化農(nóng)桿菌40
• 2.9 農(nóng)桿菌侵染40-41
• 2.10 草莓中FaMYB5基因沉默分析41-42
• 2.10.1 病毒檢測41
• 2.10.2 FaMYB5基因沉默的分子水平分析41-42
• 3 結果與分析42-44
• 3.1 VIGS載體構建42
• 3.2 草莓VIGS體系的建立42-43
• 3.3 病毒的分子檢測43
• 3.4 半定量和qRT-PCR技術對FaMYB5基因沉默效率的檢測43-44
• 4 討論44-46
• 第四章 FAMYB5基因沉默后類黃酮化合物代謝途徑相關基因和花青素苷及原花青素的變化46-58
• 1 材料與方法48-52
• 1.1 材料48
• 1.2 方法48-52
• 1.2.1 草莓FaMYB5沉默果實及陰性對照果實總RNA的提取48
• 1.2.2 類黃酮化合物代謝相關基因的引物設計與合成48-50
• 1.2.3 FaMYB5沉默后類黃酮代謝相關基因的半定量和qRT-PCR表達50-51
• 1.2.4 果實中花青素的提取和測定51
• 1.2.5 比色法測定FaMYB5沉默后草莓果實原花青素的總含量51-52
• 1.2.6 數(shù)據(jù)分析52
• 2 結果與分析52-54
• 2.1 果實中FaMYB5基因沉默后類黃酮化合物代謝途徑相關基因的變化52-53
• 2.2 果實中FaMYB5基因沉默后花青素的代謝變化53-54
• 2.3 果實中FaMYB5基因沉默后原花青素的代謝變化54
• 3 討論54-58
• 第五章 需要進一步研究的內容58-60
• 參考文獻60-71
• 附錄71-74
• 1、主要試劑配制71-73
• 2、主要使用儀器73-74
• 致謝74

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1 孫瑞W，

本文編號：391333