本文關(guān)鍵詞：豬源附紅細(xì)胞體分離鑒定PCR方法的建立及小附紅細(xì)胞體人工感染試驗(yàn)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：感染豬的附紅細(xì)胞體分為附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體兩大類(lèi)。而國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)有關(guān)小附紅細(xì)胞體分離和動(dòng)物感染試驗(yàn)的報(bào)道。通過(guò)小附紅細(xì)胞體病原的分離鑒定及動(dòng)物感染試驗(yàn),有助于了解小附紅細(xì)胞體的生物學(xué)特性及致病性。本試驗(yàn)從上海地區(qū)2個(gè)屠宰場(chǎng),采集豬抗凝血736份,提取血液基因組DNA作為模板,設(shè)計(jì)合成兩對(duì)特異性引物并驗(yàn)證了具有高度敏感性和良好特異性,用兩對(duì)特異性的引物進(jìn)行16s RNA基因部分序列的PCR擴(kuò)增、克隆、序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示,在736份血樣中,豬源附紅細(xì)胞體陽(yáng)性率為13.72%(101/756),其中小附紅細(xì)胞體陽(yáng)性率為7.34%(54/736),豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性率為4.76%(35/736),混合感染比例為1.63%(12/736),2個(gè)屠宰場(chǎng)3次采集的樣品陽(yáng)性率差異極顯著(χ2==132.841,P0.001)。嘉定區(qū)某屠宰場(chǎng)3月份的陽(yáng)性率為2.41%,5月份的陽(yáng)性率為33.21%,5月份極顯著高于3月份(χ2=81.484,P0.001)。在DNA擴(kuò)增陽(yáng)性血樣中,分別選取4份小附紅細(xì)胞體引物擴(kuò)增產(chǎn)物和4份豬附紅細(xì)胞體引物擴(kuò)增產(chǎn)物,亞克隆到pMD18-T載體后進(jìn)行測(cè)序。小附紅細(xì)胞體擴(kuò)增片段序列完全一致,長(zhǎng)度均為483 bp, BLASTn軟件在線分析顯示所獲得序列與GenBank公布的小附紅細(xì)胞體Indiana株16S rRNA基因(登錄號(hào)：NR 121759)序列同源性達(dá)100%。豬附紅細(xì)胞體擴(kuò)增片段序列也完全一致,長(zhǎng)度均為482 bp, BLASTn軟件在線分析顯示所獲得序列與GenBank公布的豬附紅細(xì)胞體Morioka5、6、8株16SrRNA基因(登錄號(hào)分別為：AB610847、AB610848、AB610849)和ZJ NB01株16S rRNA基因(登錄號(hào)：KC907396.1)序列同源性達(dá)100%,豬附紅細(xì)胞體擴(kuò)增片段與小附紅細(xì)胞體擴(kuò)增片段的同源性僅為93.6%。用小附紅細(xì)胞體陽(yáng)性血樣通過(guò)肌肉注射方法接種廣西巴馬去脾仔豬,采集血樣進(jìn)行特異性PCR檢測(cè)及序列分析。結(jié)果表明：試驗(yàn)組5頭仔豬中有2頭在接種12d、5頭在接種15d均檢出小附紅細(xì)胞體基因,人工感染豬血樣與接種原血樣DNA擴(kuò)增產(chǎn)物基因序列完全一致。這證明已經(jīng)成功建立了小附紅細(xì)胞體人工感染豬的試驗(yàn)。本研究通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明了國(guó)內(nèi)確實(shí)有豬感染小附紅細(xì)胞體,小附紅細(xì)胞體和豬附紅細(xì)胞體在16sRNA基因片段上存在差異。通過(guò)人工肌肉接種,首次建立了小附紅細(xì)胞體豬感染試驗(yàn)?zāi)Ｐ?為小附紅細(xì)胞體的生物學(xué)特性和致病性研究打下了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬源附紅細(xì)胞體 小附紅細(xì)胞體 豬附紅細(xì)胞體 16sRNA基因 特異性PCR
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S858.28
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 英文縮略表7-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-22
• 1 豬源附紅細(xì)胞體病原學(xué)研究進(jìn)展11-14
• 1.1 病原分類(lèi)11-12
• 1.2 病原形態(tài)及分布12-13
• 1.3 增殖13-14
• 2 豬附紅細(xì)胞體流行病學(xué)研究概述14
• 3 附紅細(xì)胞體病診斷手段的研究進(jìn)展14-20
• 3.1 形態(tài)學(xué)診斷14
• 3.2 血清學(xué)診斷14-17
• 3.3 分子生物學(xué)檢測(cè)17-20
• 4 小附紅細(xì)胞體的研究概述20
• 5 研究目的意義20-22
• 第二章 豬源附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)方法的建立22-29
• 1 實(shí)驗(yàn)材料22-23
• 1.1 陽(yáng)性質(zhì)粒DNA22
• 1.2 酶及試劑22
• 1.3 主要儀器22-23
• 2 實(shí)驗(yàn)方法23-24
• 2.1 特異性引物設(shè)計(jì)23
• 2.2 特異性試驗(yàn)23
• 2.3 敏感性試驗(yàn)23-24
• 3 試驗(yàn)結(jié)果24-27
• 3.1 特異性試驗(yàn)24-25
• 3.2 敏感性試驗(yàn)25-27
• 4 討論27-28
• 5 小結(jié)28-29
• 第三章 上海地區(qū)豬源附紅細(xì)胞體流行病學(xué)調(diào)查29-41
• 1 實(shí)驗(yàn)材料29-31
• 1.1 豬血液樣品29
• 1.2 主要藥品及試劑29-31
• 1.3 主要器材31
• 2 實(shí)驗(yàn)方法31-34
• 2.1 提取豬全血基因組DNA31-32
• 2.2 兩種豬源附紅細(xì)胞體的特異基因擴(kuò)增32-33
• 2.3 兩種豬源附紅細(xì)胞體引物擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物的純化(膠回收)33
• 2.4 兩種豬源附紅細(xì)胞體16S rRNA部分目的基因克隆33-34
• 2.5 兩種豬源附紅細(xì)胞體16SrRNA目的基因的鑒定(菌液PCR)34
• 3 結(jié)果34-39
• 3.1 兩種豬源附紅細(xì)胞體16SrRNA的特異性引物擴(kuò)增結(jié)果34-35
• 3.2 兩種豬源附紅細(xì)胞體16SrRNA的目的基因的鑒定35-36
• 3.3 測(cè)序結(jié)果及NCBI在線BLASR比對(duì)36-38
• 3.4 上海地區(qū)豬源附紅細(xì)胞體流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果38-39
• 4 討論39-40
• 5 小結(jié)40-41
• 第四章 小附紅細(xì)胞體人工感染豬模型初步建立41-50
• 1 實(shí)驗(yàn)材料41-43
• 1.1 豬小附紅細(xì)胞體陽(yáng)性血液樣品制備41
• 1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物41
• 1.3 主要試劑41-42
• 1.4 主要儀器42-43
• 2 試驗(yàn)方法43-44
• 2.1 預(yù)試驗(yàn)43
• 2.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理43
• 2.3 檢測(cè)指標(biāo)43-44
• 2.4 血液基因組的提取44
• 2.5 PCR檢測(cè)44
• 3 試驗(yàn)結(jié)果44-48
• 3.1 臨床癥狀44
• 3.2 姬姆薩染色結(jié)果44-46
• 3.3 血液PCR檢測(cè)46-48
• 4 討論48-50
• 全文結(jié)論50-51
• 本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 致謝58-59
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文59

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本文編號(hào)：390005