病毒病和細菌性病害是目前危害作物的兩大類重要病害。近年來,由番茄斑駁花葉病毒(Tomato mottle mosaic virus,ToMMV)引起的番茄斑駁花葉病在我國云南、海南和山東等省的茄科作物上發(fā)生流行、危害,造成了巨大的產(chǎn)量和經(jīng)濟損失。由丁香假單胞桿菌獼猴致病變種(Pseudomonas syringae pv.actinidae,Psa)引起的獼猴桃潰瘍病在我國獼猴桃產(chǎn)區(qū)也造成了毀滅性的危害,嚴重影響我國的脫貧攻堅政策和鄉(xiāng)村振興計劃。為了掌握這兩種病害的流行規(guī)律和建立科學(xué)的防控策略,急需建立這兩種病原物的快速高效檢測方法。為此,本論文分別制備了抗番茄斑駁花葉病毒和獼猴桃潰瘍病菌的單克隆抗體,并以制備的單抗為核心建立成能特異、靈敏地檢測這兩種病原物的血清學(xué)方法,從而為這兩種病害的檢測診斷和科學(xué)防控提供檢測技術(shù)和試劑。具體研究結(jié)果如下:(1)用提純的ToMMV病毒粒子為免疫原免疫BALB/c小鼠,經(jīng)雜交瘤細胞技術(shù)獲得了6株能分泌抗ToMMV單抗的雜交瘤細胞,即2D6、9C12、26A10、3A4、23A4和17B11。這些雜交瘤細胞分泌的單抗腹水的間接ELISA效價高達10

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
abstract
縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1 番茄斑駁花葉病毒的研究進展
        1.1 寄主范圍、侵染癥狀及傳播方式
        1.2 分子生物學(xué)特性和病毒粒子形態(tài)
        1.3 ToMMV檢測方法
            1.3.1 田間診斷
            1.3.2 電鏡觀察
            1.3.3 分子生物學(xué)檢測方法
            1.3.4 血清學(xué)檢測方法
        1.4 防治策略
    2 獼猴桃潰瘍病菌的研究進展
        2.1 獼猴桃潰瘍病國內(nèi)外發(fā)生情況
        2.2 獼猴桃潰瘍病病原菌
        2.3 寄主范圍及癥狀表現(xiàn)
        2.4 檢測方法
            2.4.1 田間癥狀觀察
            2.4.2 病原菌的分離鑒定
            2.4.3 分子生物學(xué)方法
        2.5 防治策略
            2.5.1 消滅傳染源
            2.5.2 切斷傳播途徑
            2.5.3 加強田間管理和提高植物抗病能力
    3 單克隆抗體技術(shù)及其在植物病毒和細菌檢測中的應(yīng)用
        3.1 單克隆抗體的研究進展
        3.2 單克隆抗體技術(shù)基本原理和基本流程
        3.3 單克隆抗體在植物病毒檢測中的應(yīng)用
        3.4 單克隆抗體在植物細菌中的應(yīng)用
    4 研究目的和意義
第二章 番茄斑駁花葉病毒單克隆抗體的創(chuàng)制及其檢測應(yīng)用
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料及試劑
        1.2 番茄斑駁花葉病毒的提純
        1.3 單克隆抗體的制備
            1.3.1 免疫動物
            1.3.2 細胞融合
            1.3.3 雜交瘤細胞、陽性孔的篩選及細胞克隆
            1.3.4 單克隆抗體腹水制備及純化
            1.3.5 單克隆抗體的亞類鑒定
            1.3.6 單抗腹水效價測定
        1.4 ToMMV單克隆抗體的Western blot分析
            1.4.1 SDS-PAGE
            1.4.2 樣品制備及電泳
            1.4.3 濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜
        1.5 檢測ToMMV的 ACP-ELISA方法的建立及單抗特性分析
            1.5.1 ACP-ELISA方法的步驟
            1.5.2 檢測ToMMV ACP-ELISA方法的建立
            1.5.3 ACP-ELISA方法的特異性和靈敏度
            1.5.4 ACP-ELISA方法田間樣品的檢測應(yīng)用
        1.6 檢測ToMMV的 dot-ELISA方法的建立及其特性分析
            1.6.1 dot-ELISA檢測步驟
            1.6.2 檢測ToMMV dot-ELISA方法的建立
            1.6.3 dot-ELISA方法檢測ToMMV的特異性和靈敏度
            1.6.4 dot-ELISA方法田間樣品的檢測應(yīng)用
        1.7 檢測ToMMV的 Tissue print-ELISA方法的建立和應(yīng)用
            1.7.1 Tissue print-ELISA操作步驟
            1.7.2 Tissue print-ELISA最適抗體工作濃度的確定
        1.8 檢測ToMMV的 RT-PCR方法
            1.8.1 植物總RNA提取
            1.8.2 RT-PCR擴增
    2 實驗結(jié)果及分析
        2.1 RT-PCR鑒定實驗材料
        2.2 ToMMV病毒粒子的提純
        2.3 雜交瘤細胞的融合、篩選和克隆
        2.4 抗體制備、效價測定及亞類的鑒定
        2.5 Western bolt分析單抗特異性
        2.6 檢測ToMMV的 ACP-ELISA方法的建立
            2.6.1 檢測ToMMV的 ACP-ELISA方法的建立
            2.6.2 ACP-ELISA方法分析單抗的特異性
            2.6.3 ACP-ELISA方法分析單抗的靈敏度
        2.7 檢測ToMMV的 dot-ELISA方法建立及特異性和靈敏度分析
            2.7.1 檢測ToMMV的 dot-ELISA方法的建立
            2.7.2 dot-ELISA方法的特異性
            2.7.3 dot-ELISA方法的靈敏度
        2.8 Tissue print-ELISA方法的建立及其特異性和靈敏度分析
            2.8.1 檢測ToMMV的 Tissue print-ELISA方法的建立
            2.8.2 Tissue print-ELISA方法分析單抗的特異性
        2.9 血清學(xué)方法在田間樣品檢測中的應(yīng)用
    3 討論
第三章 獼猴桃潰瘍病菌單克隆抗體的制備及其檢測應(yīng)用
    1 材料與方法
        1.1 菌株
        1.2 實驗試劑
        1.3 菌株培養(yǎng)及計數(shù)
        1.4 PCR方法鑒定菌株
            1.4.1 DNA提純方法
            1.4.2 常規(guī)PCR擴增
        1.5 單克隆抗體的制備
            1.5.1 免疫動物
            1.5.2 細胞融合、雜交瘤細胞的篩選、腹水制備和效價測定及抗體亞類鑒定
        1.6 血清學(xué)檢測方法的建立及其特性分析
            1.6.1 ACP-ELISA檢測方法及單抗的特異性和靈敏度
            1.6.2 dot-ELISA檢測方法的特異性和靈敏度
    2 實驗結(jié)果及分析
        2.1 獼猴桃潰瘍病細菌菌株分子鑒定
        2.2 雜交瘤細胞的融合、篩選和克隆
        2.3 單抗腹水制備、效價測定及抗體亞類鑒定
        2.4 ACP-ELISA方法的建立及其特性分析
            2.4.1 檢測Psa的 ACP-ELISA方法的建立
            2.4.2 ACP-ELISA方法的特異性分析
            2.4.3 ACP-ELISA方法的靈敏度
        2.5 dot-ELISA方法的建立及其特性分析
            2.5.1 檢測獼猴桃潰瘍病菌的dot-ELISA方法的建立
            2.5.2 dot-ELISA方法的特異性和靈敏度
            2.5.3 dot-ELISA方法對田間樣品的檢測應(yīng)用
    3 討論
全文總結(jié)
參考文獻
附錄A 常用生化與分子生物學(xué)試劑及儀器
附錄B 常用緩沖液和培養(yǎng)基配方



本文編號：3880278