包蟲病是由中絳期細(xì)粒棘球絳蟲引起的,該病在全球范圍內(nèi)均有分布,我國(guó)是該病高發(fā)的國(guó)家和地區(qū)之一。該病危害性大,患者10年病死率高達(dá)94%。防控措施以吡喹酮犬犬投藥月月驅(qū)蟲為主,盡管有效,但是在基層難以長(zhǎng)期堅(jiān)持,而且流浪狗難以管理;針對(duì)中間宿主的EG95疫苗對(duì)移行期內(nèi)的病原防控有效,但是終末宿主與中間宿主數(shù)量比達(dá)到45:1,防控成本很高;因此,建立針對(duì)終末宿主有效的免疫預(yù)防方法是防控該病的一致研究方向。國(guó)內(nèi)外研究表明,四跨膜蛋白家族(TSP)在寄生蟲的研究中具有很好的免疫原價(jià)值,因此,本試驗(yàn)針對(duì)Eg-TSP14和Eg-TSP33進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)以及免疫原性初步研究,以期為Eg-TSP14和Eg-TSP33是否具有作為疫苗候選抗原的潛力提供理論基礎(chǔ)。目的:克隆Eg-TSP14以及Eg-TSP33基因,并構(gòu)建重組pET-32a-TSP14以及pET-32a-TSP33質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá),并將重組蛋白免疫小鼠對(duì)其免疫原性進(jìn)行初步研究。方法:(1)以細(xì)粒棘球絳蟲成蟲、原頭蚴和包囊壁的cDNA為模板,利用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增,分析兩個(gè)基因在蟲體不同發(fā)育階段的差異表達(dá)情況。(...

【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
引言
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 E.granulosus形態(tài)學(xué)特點(diǎn)
    2 E.g.生活史
    3 流行病學(xué)
        3.1 流行狀況
        3.2 流行因素
    4 診斷方法
        4.1 常規(guī)診斷方法
        4.2 血清學(xué)診斷
    5 細(xì)粒棘球蚴病防治策略
        5.1 EG95
        5.2 EgM蛋白家族
        5.3 EgA31
        5.4 Eg14-3-3 蛋白
    6 四跨膜蛋白
        6.1 四跨膜蛋白的生物功能
        6.2 四跨膜蛋白在寄生蟲中的研究進(jìn)展
第二章 試驗(yàn)部分
    試驗(yàn)一 細(xì)粒棘球絳蟲TSP14、TSP33 基因的克隆、序列分析及不同發(fā)育階段表達(dá)分析
        1 材料
            1.1 細(xì)粒棘球蚴、包囊壁和成蟲
            1.2 主要儀器設(shè)備
            1.3 主要試劑
        2 方法
            2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
            2.2 引物設(shè)計(jì)與合成
            2.3 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 基因的擴(kuò)增
            2.4 基因擴(kuò)增產(chǎn)物的回收
            2.5 載體的連接
            2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.7 菌液PCR
            2.8 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33生物信息學(xué)分析
            2.9 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
        3 結(jié)果
            3.1 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 基因的克隆
            3.2 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 基因的序列分析
            3.3 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)
            3.4 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 結(jié)構(gòu)域分析
            3.5 B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)
            3.6 同源序列比對(duì)
            3.7 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
        4 討論
        5 小結(jié)
    試驗(yàn)二 細(xì)粒棘球絳蟲TSP14 以及TSP33 非跨膜區(qū)的克隆及原核表達(dá)
        1 材料
            1.1 cDNA
            1.2 主要儀器設(shè)備
            1.3 主要試劑與耗材
            1.4 主要溶液配制
        2 方法
            2.1 總RNA提取
            2.2 引物設(shè)計(jì)
            2.3 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 非跨膜區(qū)片段的克隆
            2.4 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 非跨膜區(qū)片段的原核表達(dá)
        3 結(jié)果
            3.1 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 非跨膜區(qū)片段的擴(kuò)增
            3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及雙酶切鑒定
            3.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
            3.4 重組蛋白表達(dá)形式分析、純化及定量
        4 討論
        5 小結(jié)
    試驗(yàn)三 Eg-TSP14及Eg-TSP33 蛋白免疫原性初步探究
        1 材料
            1.1 試驗(yàn)材料
            1.2 主要儀器與設(shè)備
            1.3 主要試劑
            1.4 試劑的配方
        2 方法
            2.1 Eg-TSP14及Eg-TSP33 高免血清的制備
            2.2 Western Blotting
            2.3 ELISA檢測(cè)免疫小鼠的血清抗體滴度
            2.4 qPCR測(cè)定細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)變化
        3 結(jié)果
            3.1 Western Blot
            3.2 間接ELISA檢測(cè)免疫后小鼠抗體IgG
            3.3 免疫后小鼠細(xì)胞因子檢測(cè)
        4 討論
        5 小結(jié)
全文結(jié)論
創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介
附件



本文編號(hào)：3759933