發(fā)布時間：2023-03-11 17:22

　　包蟲病是由中絳期細粒棘球絳蟲引起的,該病在全球范圍內(nèi)均有分布,我國是該病高發(fā)的國家和地區(qū)之一。該病危害性大,患者10年病死率高達94%。防控措施以吡喹酮犬犬投藥月月驅(qū)蟲為主,盡管有效,但是在基層難以長期堅持,而且流浪狗難以管理;針對中間宿主的EG95疫苗對移行期內(nèi)的病原防控有效,但是終末宿主與中間宿主數(shù)量比達到45:1,防控成本很高;因此,建立針對終末宿主有效的免疫預防方法是防控該病的一致研究方向。國內(nèi)外研究表明,四跨膜蛋白家族(TSP)在寄生蟲的研究中具有很好的免疫原價值,因此,本試驗針對Eg-TSP14和Eg-TSP33進行了克隆、原核表達以及免疫原性初步研究,以期為Eg-TSP14和Eg-TSP33是否具有作為疫苗候選抗原的潛力提供理論基礎。目的:克隆Eg-TSP14以及Eg-TSP33基因,并構(gòu)建重組pET-32a-TSP14以及pET-32a-TSP33質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進行原核表達,并將重組蛋白免疫小鼠對其免疫原性進行初步研究。方法:(1)以細粒棘球絳蟲成蟲、原頭蚴和包囊壁的cDNA為模板,利用熒光定量PCR技術進行擴增,分析兩個基因在蟲體不同發(fā)育階段的差異表達情況。(...

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
引言
第一章 文獻綜述
    1 E.granulosus形態(tài)學特點
    2 E.g.生活史
    3 流行病學
        3.1 流行狀況
        3.2 流行因素
    4 診斷方法
        4.1 常規(guī)診斷方法
        4.2 血清學診斷
    5 細粒棘球蚴病防治策略
        5.1 EG95
        5.2 EgM蛋白家族
        5.3 EgA31
        5.4 Eg14-3-3 蛋白
    6 四跨膜蛋白
        6.1 四跨膜蛋白的生物功能
        6.2 四跨膜蛋白在寄生蟲中的研究進展
第二章 試驗部分
    試驗一 細粒棘球絳蟲TSP14、TSP33 基因的克隆、序列分析及不同發(fā)育階段表達分析
        1 材料
            1.1 細粒棘球蚴、包囊壁和成蟲
            1.2 主要儀器設備
            1.3 主要試劑
        2 方法
            2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
            2.2 引物設計與合成
            2.3 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 基因的擴增
            2.4 基因擴增產(chǎn)物的回收
            2.5 載體的連接
            2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.7 菌液PCR
            2.8 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33生物信息學分析
            2.9 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33實時熒光定量PCR檢測
        3 結(jié)果
            3.1 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 基因的克隆
            3.2 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 基因的序列分析
            3.3 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)
            3.4 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 結(jié)構(gòu)域分析
            3.5 B細胞表位預測
            3.6 同源序列比對
            3.7 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 RT-PCR檢測結(jié)果
        4 討論
        5 小結(jié)
    試驗二 細粒棘球絳蟲TSP14 以及TSP33 非跨膜區(qū)的克隆及原核表達
        1 材料
            1.1 cDNA
            1.2 主要儀器設備
            1.3 主要試劑與耗材
            1.4 主要溶液配制
        2 方法
            2.1 總RNA提取
            2.2 引物設計
            2.3 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 非跨膜區(qū)片段的克隆
            2.4 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 非跨膜區(qū)片段的原核表達
        3 結(jié)果
            3.1 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 非跨膜區(qū)片段的擴增
            3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及雙酶切鑒定
            3.3 重組蛋白的誘導表達
            3.4 重組蛋白表達形式分析、純化及定量
        4 討論
        5 小結(jié)
    試驗三 Eg-TSP14及Eg-TSP33 蛋白免疫原性初步探究
        1 材料
            1.1 試驗材料
            1.2 主要儀器與設備
            1.3 主要試劑
            1.4 試劑的配方
        2 方法
            2.1 Eg-TSP14及Eg-TSP33 高免血清的制備
            2.2 Western Blotting
            2.3 ELISA檢測免疫小鼠的血清抗體滴度
            2.4 qPCR測定細胞因子動態(tài)變化
        3 結(jié)果
            3.1 Western Blot
            3.2 間接ELISA檢測免疫后小鼠抗體IgG
            3.3 免疫后小鼠細胞因子檢測
        4 討論
        5 小結(jié)
全文結(jié)論
創(chuàng)新點
參考文獻
致謝
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本文編號：3759933