本文關(guān)鍵詞：褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）Trx1，TRP14 和Prx1基因的克隆、表達和轉(zhuǎn)錄水平的免疫刺激反應，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一種非常珍貴的經(jīng)濟魚類,隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大化,養(yǎng)殖中面臨的魚類疾病感染問題愈發(fā)嚴峻。為了更好地找到解決問題的辦法,了解魚類的免疫機制是很必要的。本文主要是研究了三個褐牙鲆抗氧化相關(guān)基因硫氧還蛋白1基因(thioredoxin 1, PoTrx1)、硫氧還蛋白相關(guān)蛋白14 (thioredoxin related protein 14, PoTRP14)和過氧化物酶基因1 (Peroxidase 1, PoPrx1)基因的基因序列信息和各組織、不同發(fā)育時期的表達差異,以及在接受免疫刺激的條件下,表達模式會有何變化。本研究采用RACE (Rapid amplification of cDNA ends, RACE)技術(shù)克隆得到PoTrx1、PoTRP14基因的cDNA全長,并運用各種生物信息學軟件對序列信息進行分析和預測,預測了所編碼相關(guān)蛋白的基本信息、進行了物種間同源性的分析,并構(gòu)建了各物種間的進化樹。RT-PCR法分析了PoTrx1、PoTRP14基因在成體魚八個不同組織和十四個不同胚胎發(fā)育時期的表達差異。同時建立了褐牙鲆肝臟細胞原代培養(yǎng)系統(tǒng),分別用LPS、CuSO4和H202刺激肝臟細胞,然后用RT-PCR法分析免疫刺激前后PoTrx1、PoTRP14和PoPrx1基因的表達模式有何變化。研究成果作如下分述：1、PoTrx1基因全長cDNA的克隆和表達分析運用RACE技術(shù)克隆得到PoTrx1基因cDNA全長為723bp,其中包括366bp的開放閱讀框(ORF)、324bp的3’-UTR和33bp的5’.UTR。預測該基因可編碼121個氨基酸,理論分子量為15.90kDa,理論等電點為5.39。ORF中具有Trxl基因典型的保守區(qū)CGPC。同時分析了Trx1在不同物種之間的相似性,其中PoTrx1同半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)、條石鯛(Oplegnathus fasciatus)和松江鱸(Trachidermus fasciatus)的一致度分別為：60%、67%和61%。RT-PCR法檢測顯示PoTrx1在成體魚八個組織中都有表達,尤其在小腸中的表達量最高,其次為腎臟、心臟、肝臟、腦和鰓,在肌肉組織中的表達量最低。組織表達的差異中,PoTrxl基因在免疫相關(guān)器官中的表達較高,這與Trx1執(zhí)行的免疫功能相關(guān)。同時檢測了PoTrx1基因在14個胚胎不同發(fā)育時期的表達情況,各發(fā)育時期的表達量有顯著的差異,PoTrx1在未受精卵時期就已經(jīng)開始表達,然而從1細胞期開始直到囊胚期的表達量都是相對穩(wěn)定的低表達量,從神經(jīng)胚期開始,表達量劇增,在體節(jié)期達到高峰,出膜期以及出膜一天表達量開始下降。建立褐牙鲆肝臟細胞原代培養(yǎng)系統(tǒng),選用LPS、CuSO4和H2O2三組刺激物刺激肝臟細胞,PoTrx1的表達出現(xiàn)了顯著的上調(diào)。LPS刺激之后,6h之后達到一個表達的高峰,隨后在24h之后又出現(xiàn)的新的表達高峰；CuSO4刺激之后2h后迅速達到高峰,隨后降低,維持一個較低的表達水平,在48h又出現(xiàn)了新的表達高峰；H2O2刺激組則是在12h和24h出現(xiàn)了明顯的表達高峰。免疫刺激之后,PoTrx1表達量的上調(diào)說明Trx1基因功能同機體的免疫和抗氧化密不可分。2.PoTRP14基因全長cDNA的克隆和表達分析PoTRP14基因cDNA序列全長為909bp,其中包括58bp的5’-UTR區(qū)和479bp的3’-UTR區(qū),預測372bp的ORF區(qū)可編碼123個氨基酸,理論分子量和理論等電點分別為14.01kDa和5.70。ORF區(qū)具有TRPl4基因共有的CPDC保守序列。PoTRP14同裸蓋魚(Anoplopoma fimbria)、大西洋鮭(Salmo salar)和點帶石斑魚(Epinephelus coioides)的一致度均為87%,同松江鱸(Trachidermus fasciatus)的一致度為86%。經(jīng)RT-PCR檢測分析,PoTRP14在各組織中都有表達,小腸中的表達量最高,其次為腎臟、心臟、肝臟、腦和鰓,在脾臟組織中的表達量最低。PoTRP14基因在不同胚胎發(fā)育時期的表達總體維持著較高的表達量,在未受精卵中有較高的表達量,隨后的幾個時期表達量相對穩(wěn)定,高囊胚期相對低,在出膜前表達量出現(xiàn)一個急劇增長的表達高峰,隨后急劇下降。PoTRP14基因在免疫刺激后肝臟細胞中的表達亦出現(xiàn)明顯的上調(diào),PoTRP14基因在LPS刺激后的6h和48h分別出現(xiàn)表達高峰；CuSO4刺激的2h和48h出現(xiàn)表達高峰,明顯高于其他實驗組；H2O2刺激后的12h和48h有表達高峰。3.PoPrx1基因全長cDNA的克隆和表達分析在免疫刺激實驗中,PoPrx1基因的表達變化總體上是上調(diào)趨勢。LPS刺激肝臟細胞后,PoPrx1基因的表達在6h和24h分別出現(xiàn)表達高峰；CuSO4刺激之后,2h和48h出現(xiàn)表達高峰；H202刺激組則是在12h和48h有表達高峰。本文所研究的三個抗氧化相關(guān)基因PoPrx1和PoTrx1、PoTRP14表達模式變化趨勢大同小異,說明這三個基因在執(zhí)行免疫防御功能和抗氧化機制上具有相似的特點。
【關(guān)鍵詞】：褐牙鲆 PoTrx1 PoTRP14 PoPrx1 抗氧化 免疫刺激
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-15
• 第一章 文獻綜述15-33
• 第一節(jié) 魚類免疫系統(tǒng)研究概述16-17
• 第二節(jié) 魚類抗氧化機制研究概述17-21
• 第三節(jié) 硫氧還蛋白基因研究進展21-26
• 1.3.1 硫氧還蛋白的研究進展21-24
• 1.3.2 硫氧還蛋白基因家族的生物學功能24-26
• 第四節(jié) 硫氧還蛋白相關(guān)蛋白TRP14的研究進展26-27
• 第五節(jié) 硫氧還蛋白過氧化物酶Prx的研究進展27-29
• 第六節(jié) 魚類細胞培養(yǎng)研究進展29-31
• 第七節(jié) 本論文研究的方法、意義31-33
• 1.7.1 本研究的方法31-32
• 1.7.2 本研究的意義32-33
• 第二章 PoTrx1和PoTRP14基因的克隆33-57
• 2.1 引言33
• 2.2 材料方法33-47
• 2.2.1 實驗材料33-36
• 2.2.1.1 實驗動物和取材33-34
• 2.2.1.2 實驗試劑和藥品34
• 2.2.1.3 實驗儀器設(shè)備34-35
• 2.2.1.4 主要試劑及配置方法35-36
• 2.2.2 實驗中的引物36-37
• 2.2.3 總RNA的提取和純化37-39
• 2.2.3.1 總RNA的提取37-38
• 2.2.3.2 總RNA的純化38-39
• 2.2.4 cDNA第一鏈的合成39-40
• 2.2.5 PoTrx1基因和PoTRP14基因核心片段的獲得40-42
• 2.2.5.1 PoTrx1基因和PoTRP14基因核心片段的克隆40
• 2.2.5.2 PCR產(chǎn)物的回收和純化40-41
• 2.2.5.3 連接反應41
• 2.2.5.4 感受態(tài)細胞的制備(氯化鈣法)41-42
• 2.2.5.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和陽性克隆的篩選42
• 2.2.6 PoTrx1基因和PoTRP14基因3’UTR片段的獲得42-45
• 2.2.6.1 3’cDNA的合成44
• 2.2.6.2 3’RACE半巢式PCR44-45
• 2.2.7 PoTrx1基因和PoTRPl4基因5'UTR片段的獲得45-47
• 2.2.7.1 5’cDNA的合成46
• 2.2.7.2 5’RACE半巢式PCR46-47
• 2.2.8 PoTrx1基因和PoTRP14基因的序列分析、同源比對和進化樹構(gòu)建47
• 2.3 實驗結(jié)果47-55
• 2.3.1 總RNA的提取47-48
• 2.3.2 PoTrx1和PoTRP14基因全長cDNA序列的獲得48-50
• 2.3.3 PoTrx1和PoTRP14基因同源性分析50-53
• 2.3.4 PoTrx1和PoTRP14基因進化樹的構(gòu)建53-55
• 2.4 討論55-57
• 第三章 PoTrx1和PoTRP14基因表達分析57-71
• 3.1 引言57
• 3.2 實驗方法57-62
• 3.2.1 cDNA制備57-58
• 3.2.2 實時熒光定量Real-time PCR58-60
• 3.2.2.1 RT-PCR實驗簡介58-59
• 3.2.2.2 RT-PCR反應步驟59-60
• 3.2.2.3 數(shù)據(jù)處理60
• 3.2.3 免疫刺激后PoTrx1基因和PoTRP14基因的表達模式60-62
• 3.2.3.1 褐牙鲆肝臟原代細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的建立(酶消化法)60-61
• 3.2.3.2 LPS、CuSO_4和H_2O_2刺激褐牙鲆肝細胞61
• 3.2.3.3 mRNA的提取和反轉(zhuǎn)錄61
• 3.2.3.4 LPS、CuSO_4和H_2O_2刺激褐牙鲆肝臟細胞后PoTrx1基因和PoTRP14基因的表達模式61-62
• 3.3 實驗結(jié)果62-67
• 3.3.1 PoTrx1的組織差異性表達62-63
• 3.3.2 PoTRP14的組織差異性表達63
• 3.3.3 PoTrx1不同發(fā)育時期表達差異63-64
• 3.3.4 PoTRP14不同發(fā)育時期表達差異64-65
• 3.3.5 免疫刺激前后PoTrx1基因的表達模式65-66
• 3.3.6 免疫刺激前后PoTRP14基因的表達模式66-67
• 3.4 討論67-71
• 第四章 PoPrx1基因免疫刺激后表達模式71-74
• 4.1 引言71
• 4.2 實驗方法71-72
• 4.2.1 mRNA的提取和反轉(zhuǎn)錄71
• 4.2.2 LPS、CuSO_4和H_2O_2刺激褐牙鲆肝臟細胞后PoPrx1基因表達模式71-72
• 4.3 實驗結(jié)果72-73
• 4.4 討論73-74
• 參考文獻74-83
• 致謝83-84
• 個人簡歷84-85
• 在學期間發(fā)表的學術(shù)論文與研究成果85

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