番茄作為一種重要的經(jīng)濟作物,在世界范圍內(nèi)廣泛種植。而番茄病毒病嚴重限制了番茄的質(zhì)量與產(chǎn)量。目前對番茄病毒病的主要防治措施有培育抗性品種和使用化學(xué)藥劑,但是效果均不理想。RNA干擾（RNAi）是由雙鏈RNA（double-stranded RNA,dsRNA）引起的序列特異性沉默,它是真核生物中常見的抵抗外源核酸入侵的防御機制。借助基因工程的方法,將含有病毒基因的RNAi載體轉(zhuǎn)化植物,能夠獲得高抗植物病毒病的轉(zhuǎn)基因植株。但公眾對轉(zhuǎn)基因作物安全性的擔憂,限制了抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的推廣應(yīng)用。開發(fā)新的更加安全有效的RNAi載體應(yīng)用方法有著重要的應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義。RNAi療法（RNAi therapy）是指通過局部表達某病原的雙鏈RNA,阻斷RNA表達蛋白質(zhì),治療相關(guān)的疾病的方法。而且RNAi產(chǎn)生的小分子干擾RNA（small interference RNA,siRNA）具有可傳遞性,因此可以實現(xiàn)系統(tǒng)的基因沉默,類似疫苗的作用,亦可稱為“siRNA疫苗”。本研究,在分離鑒定了番茄上主要病毒的基礎(chǔ)上,借鑒于“RNAi療法”的原理,體外構(gòu)建含多種番茄病毒功能基因的RNAi載體（在植物中表達后可產(chǎn)生... 

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
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1 前言
    1.1 番茄病毒病的主要種類及危害
        1.1.1 番茄黃化曲葉病毒
        1.1.2 番茄褪綠病毒
        1.1.3 番茄斑萎病毒
        1.1.4 番茄花葉病毒
    1.2 RNAi療法
        1.2.1 RNAi技術(shù)發(fā)展
        1.2.2 RNAi技術(shù)原理
        1.2.3 RNAi在植物抗病毒中的研究
        1.2.4 RNAi療法的特點
        1.2.5 RNAi療法的發(fā)展前景
    1.3 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 供試植物
        2.1.2 毒源
        2.1.3 菌株和載體
        2.1.4 酶和常用生化試劑
        2.1.5 實驗所用試劑及配制
    2.2 試驗方法
        2.2.1 植物總DNA的提取
        2.2.2 植物總RNA的提取
        2.2.3 引物的設(shè)計與合成
        2.2.4 cDNA合成
        2.2.5 重疊PCR構(gòu)建“siRNA疫苗”載體
            2.2.5.1 目的基因片段的擴增
            2.2.5.2 擴增片段的回收
            2.2.5.3 目的基因連接克隆載體
            2.2.5.4 大腸桿菌感受態(tài)制備
            2.2.5.5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌
            2.2.5.6 陽性克隆的PCR鑒定
            2.2.5.7 質(zhì)粒DNA的提取
            2.2.5.8 質(zhì)粒酶切與回收
            2.2.5.9 “siRNA疫苗”載體的構(gòu)建
        2.2.6 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
            2.2.6.1 制備根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)
            2.2.6.2 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        2.2.7 農(nóng)桿菌侵染植株
        2.2.8 Northern blot分析
            2.2.8.1 熱酚法提取植物總RNA
            2.2.8.2 植物小分子RNA的提取
            2.2.8.3 總RNA電泳
            2.2.8.4 小分子RNA電泳
            2.2.8.5 總RNA的轉(zhuǎn)膜
            2.2.8.6 小分子RNA轉(zhuǎn)膜
            2.2.8.7 合成探針
            2.2.8.8 探針濃度的檢測
            2.2.8.9 Northern blot雜交
        2.2.9 實時熒光定量PCR檢測病毒含量
        2.2.10 “siRNA疫苗”的抗病毒試驗
            2.2.10.1 室內(nèi)試驗
            2.2.10.2 大田實驗
3 結(jié)果與分析
    3.1 山東省與遼寧丹東番茄病毒病的鑒定結(jié)果
        3.1.1 山東省與遼寧丹東番茄病毒病的主要種類
        3.1.2 番茄病毒的檢出率
    3.2 TMV“siRNA疫苗”的病毒防效測定
        3.2.1 TMV“siRNA疫苗”的病毒防效
        3.2.2 “siRNA疫苗”處理煙草Northern Blot分析
    3.3 山東主要番茄病毒“siRNA疫苗”載體的構(gòu)建
        3.3.1 番茄病毒siRNA產(chǎn)生位點的預(yù)測
        3.3.2 目的基因片段的擴增
            3.3.2.1 “siRNA疫苗”載體正反向片段的獲得
            3.3.2.2 反向目的片段與表達載體連接
            3.3.2.3 正向片段連接重組中間載體
            3.3.2.4 “siRNA疫苗”載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
    3.4 “siRNA疫苗”抗番茄病毒的室內(nèi)試驗
        3.4.1 “siRNA疫苗”不同濃度處理對病毒的防治效果
        3.4.2 “siRNA疫苗”不同處理方式對病毒防效的影響
        3.4.3 源于病毒不同功能基因的“siRNA疫苗”對病毒防效的影響
    3.5 番茄病毒“siRNA疫苗”的田間防效試驗
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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[8]番茄黃化曲葉病毒病的研究進展[J]. 苗相偉.  中國果菜. 2017(03)
[9]油菜花葉病毒山西地黃分離物的全基因組序列測定與分析[J]. 王德富,張西梅,楊鋒,牛顏冰.  植物病理學(xué)報. 2016(05)
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博士論文
[1]煙粉虱—中國番茄黃曲葉病毒—寄主植物互作關(guān)系與營養(yǎng)機制的研究[D]. 劉劍.浙江大學(xué) 2009

碩士論文
[1]北方三省區(qū)番茄病毒病病原分子鑒定及番茄花葉病毒全基因組序列分析[D]. 楊園園.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定、遺傳多樣性分析及其誘導(dǎo)抗性相關(guān)基因的分離[D]. 袁偉.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[3]新疆加工番茄上番茄花葉病毒的分子檢測及全序列測定[D]. 姜玉霞.石河子大學(xué) 2008



本文編號：3688152