本研究的目的是構(gòu)建藏系綿羊Gasdermin基因家族成員GSDMA基因的表達(dá)載體,在細(xì)胞水平上探索GSDMA基因在毛囊細(xì)胞中可能發(fā)揮的調(diào)控機(jī)制,為進(jìn)一步研究綿羊GSDMA基因在毛囊發(fā)育與周期變化中的功能提供理論基礎(chǔ)。試驗(yàn)以藏系綿羊母羊?yàn)檠芯繉?duì)象,從皮膚中克隆了藏系綿羊GSDMA基因序列,并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了皮膚特異的真核表達(dá)載體,進(jìn)一步轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人毛囊內(nèi)根鞘細(xì)胞（Human hair inner root sheath cells,HHIRSC）,利用熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)藏系綿羊GSDMA基因以及與毛囊生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的Wnt通路信號(hào)分子β-catenin基因m RNA和蛋白質(zhì)水平的變化。主要研究成果如下:（1）獲得了藏系綿羊GSDMA基因的CDS編碼區(qū)序列,長(zhǎng)度為1341 bp。CDS區(qū)序列比對(duì)顯示,GSDMA基因與預(yù)測(cè)的綿羊序列存2個(gè)堿基差異,但氨基酸序列相同。（2）以pCDs Red2-KI真核載體為骨架,構(gòu)建了含KAP6.1皮膚特異表達(dá)啟動(dòng)子的GSDMA基因重組真核載體p CDs R-KG。（3）將p CDs R-KG轉(zhuǎn)染HHIRSC,用流式細(xì)胞術(shù)分選紅色... 

【文章頁(yè)數(shù)】：49 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1 毛囊與羊絨毛性狀
    2 羊絨毛性狀的主要候選基因
        2.1 BMP基因家族
        2.2 Hox基因家族
        2.3 FGFs
        2.4 胰島素樣生長(zhǎng)因子
        2.5 GSDMA
第2章 藏系綿羊GSDMA基因的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 樣品的采集與處理
        1.2 主要試劑與儀器
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 總RNA的提取與PCR擴(kuò)增
        2.2 基因的克隆測(cè)序及雙酶切引物設(shè)計(jì)
        2.3 含酶切位點(diǎn)GSDMA基因和pCDsRed2-KI載體的擴(kuò)增
        2.4 皮膚特異表達(dá)載體pCDsR-KG的構(gòu)建
        2.5 pCDsR-KG載體的鑒定
    3 結(jié)果與分析
        3.1 藏系綿羊GSDMA基因的PCR擴(kuò)增
        3.2 GSDMA的基因克隆
        3.3 測(cè)序及分析
        3.4 GSDMA基因擴(kuò)增和真核載體的轉(zhuǎn)化
        3.5 pCDsRed2-KG真核載體的鑒定
    4.討論
第3章 GSDMA基因真核載體的轉(zhuǎn)染及功能分析
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 樣品
        1.2 主要試劑與儀器
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 HHIRSC細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代
        2.2 轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化
        2.3 pCDsR-KG載體的轉(zhuǎn)染與篩選
        2.4 流式細(xì)胞術(shù)篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞
        2.5 篩選后細(xì)胞RNA及總蛋白的獲得
        2.6 GSDMA及 β-catenin基因熒光定量PCR分析
        2.7 Western blot分析 β-catenin蛋白表達(dá)差異
    3 結(jié)果與分析
        3.1 轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化
        3.2 轉(zhuǎn)染結(jié)果分析
        3.3 流式細(xì)胞術(shù)篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞
        3.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞RNA及總蛋白的獲得
        3.5 GSDMA及 β-catenin基因的定量
        3.6 β-catenin基因的蛋白水平分析
    4 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]與毛囊生長(zhǎng)發(fā)育及羊毛、羊絨品質(zhì)相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J]. 田月珍,黃錫霞,柏妍,田可川,徐新明,吳偉偉,哈尼克孜.  中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué). 2013(03)
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[10]與絨山羊絨毛生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)的研究進(jìn)展[J]. 邵美麗,單玉蘭,劉皙潔.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2004(04)

博士論文
[1]成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5（FGF5）基因cDNA克隆及在不同品種綿羊和山羊中的多態(tài)性研究[D]. 高愛琴.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005
[2]內(nèi)蒙古絨山羊毛囊發(fā)育、生長(zhǎng)周期及相關(guān)基因的研究[D]. 尹俊.內(nèi)蒙古大學(xué) 2004

碩士論文
[1]角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因（KAP和KRT）與綿羊毛品質(zhì)的相關(guān)性研究[D]. 許漢峰.石河子大學(xué) 2008



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