小麥赤霉�。‵usarium Head Blight,FHB）是一種流行范圍廣,危害力大的真菌病害,控制小麥赤霉病的發(fā)病不僅能夠保障農(nóng)作物的健康生長以及產(chǎn)量,而且對于食品營養(yǎng)與安全具有重要的意義。RNA干擾（RNA interference,RNAi）是一種具有廣闊前景的基因編輯技術(shù),可以對無法通過基因敲除的必需基因進(jìn)行基因沉默,即通過對目的基因進(jìn)行干擾,使該基因的表達(dá)量在一定程度上被抑制,從而達(dá)到減弱基因表達(dá)的效果,減輕病害和產(chǎn)毒。本研究首先通過基因敲除驗(yàn)證了禾谷鐮刀菌鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶基因CNA和CNB為必需基因,然后構(gòu)建了FgCNA和FgCNB基因沉默載體,研究了其對禾谷鐮刀菌生理功能的影響,并且通過體外合成雙鏈RNA,噴施大麥葉片驗(yàn)證了其抑制鐮刀菌侵染的效果,為小麥赤霉病的高效、綠色安全防控奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:（1）通過基因敲除技術(shù)及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化無法獲得敲除突變體,利用PCR技術(shù)驗(yàn)證了所有轉(zhuǎn)化體均為異位插入突變體,證明FgCNA和FgCNB基因?yàn)榍贸滤阑�。�?）通過構(gòu)建沉默載體,利用聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法,將沉默載體轉(zhuǎn)化進(jìn)禾谷鐮刀菌PH-1中,篩選獲... 

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 RNA干擾
    1.2 基因沉默技術(shù)在治理小麥赤霉病中的最新研究進(jìn)展
        1.2.1 小麥赤霉病
        1.2.2 禾谷鐮刀菌及其侵染過程簡介
        1.2.3 FHB的防治策略
        1.2.4 RNAi與寄主誘導(dǎo)的基因沉默
        1.2.5 HIGS與禾谷鐮刀菌引起的赤霉病
        1.2.6 優(yōu)勢與挑戰(zhàn)
        1.2.7 RNAi的應(yīng)用
    1.3 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶
        1.3.1 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶簡介
        1.3.2 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的作用
    1.4 RNA干擾的應(yīng)用前景
    1.5 研究目的與意義
    1.6 研究內(nèi)容
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)品種
        2.1.3 載體與菌株
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)引物
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.6 培養(yǎng)基及試劑的配制
        2.1.7 主要儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 基因敲除
            2.2.1.1 菌株的活化
            2.2.1.2 基因組DNA的提取
            2.2.1.3 用于FgCNA和 FgCNB基因敲除的線性DNA片段的構(gòu)建
            2.2.1.4 PCR產(chǎn)物純化
            2.2.1.5 膠回收
            2.2.1.6 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
            2.2.1.7 PCR驗(yàn)證
        2.2.2 基因沉默
            2.2.2.1 沉默載體的構(gòu)建
            2.2.2.2 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
        2.2.3 熒光定量PCR驗(yàn)證基因表達(dá)量
            2.2.3.1 RNA的提取
            2.2.3.2 反轉(zhuǎn)錄
            2.2.3.3 PCR
        2.2.4 沉默菌株的表型測定
            2.2.4.1 生長速度的測定
            2.2.4.2 產(chǎn)孢能力的測定
            2.2.4.3 孢子長度及隔膜數(shù)目的測定
            2.2.4.4 耐鹽脅迫
            2.2.4.5 耐堿脅迫
            2.2.4.6 產(chǎn)毒能力的測定
            2.2.4.7 致病力的測定
        2.2.5應(yīng)用實(shí)驗(yàn)
            2.2.5.1 體外合成RNA
            2.2.5.2 雙鏈RNA噴施抑制鐮刀菌侵染試驗(yàn)
3 結(jié)果與分析
    3.1 基因敲除
        3.1.1 用于FgCNA和 FgCNB基因敲除的線性DNA片段的構(gòu)建
        3.1.2 基因敲除和PCR驗(yàn)證
    3.2 基因沉默
        3.2.1 PCR擴(kuò)增目的基因片段驗(yàn)證
        3.2.2 酶切與連接
        3.2.3 反向片段的插入驗(yàn)證
    3.3 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化獲得沉默轉(zhuǎn)化子
    3.4 熒光定量PCR驗(yàn)證基因表達(dá)量
    3.5 沉默菌株的生理功能測定
        3.5.1 生長速度的測定
        3.5.2 產(chǎn)孢能力的測定
        3.5.3 孢子長度及隔膜數(shù)目的測定
        3.5.4 耐鹽脅迫
        3.5.5 耐堿脅迫
        3.5.6 產(chǎn)毒能力的測定
        3.5.7 致病力的測定
        3.5.8 應(yīng)用實(shí)驗(yàn)
            3.5.8.1 擴(kuò)增模板基因片段
            3.5.8.2 合成雙鏈RNA和噴施抑制鐮刀菌侵染試驗(yàn)
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3675086