胎衣不下（RFM）是奶牛常見的一種繁殖障礙疾病,以往研究已經(jīng)證實其發(fā)生與細胞凋亡及機體抗氧化狀態(tài)密切相關(guān),本團隊在前期研究中發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白27（HSP27）在RFM奶牛胎盤組織中呈現(xiàn)顯著升高,而HSP27在機體抗氧化和細胞凋亡生物過程中發(fā)揮著重要的作用。因此,本實驗擬通過體內(nèi)體外兩部分實驗,應(yīng)用生物化學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)確定HSP27、細胞凋亡相關(guān)因子及細胞內(nèi)ROS與奶牛RFM發(fā)生的相關(guān)性,并在建立奶牛原代上皮細胞氧化應(yīng)激模型的基礎(chǔ)上,探究HSP27是否是通過細胞凋亡和氧化應(yīng)激兩種途徑參與胎衣不下的發(fā)生,并闡明HSP27參與RFM發(fā)生過程中的作用機制,從而為進一步揭示奶牛胎衣不下發(fā)病機理提供理論基礎(chǔ)。本研究選取泌乳量、年齡、體重和胎次都相近,且無其他疾病的RFM奶牛和胎衣正常排出奶牛7頭,產(chǎn)后12 h分別采取其血液及母體胎盤組織。通過ELISA法檢測血清中HSP27的濃度,然后再通過qRT-PCR和Western blot法檢測HSP27介導(dǎo)的信號通路中HSP27、Akt、p-Akt、p-IKK、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Bad、Bcl-xl、Bcl-2的表達,之后檢測... 

【文章來源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)黑龍江省

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

奶牛胎盤結(jié)構(gòu)（圖片引自Dr.LindertBenedictus）

HSP27通過抗氧化應(yīng)激及細胞凋亡途徑調(diào)控奶牛RFM發(fā)生作用機制的研究4圖1.1奶牛胎盤結(jié)構(gòu)（圖片引自Dr.LindertBenedictus）Fig1.1Structureofbovineplacentomes.（CourtesyofDr.LindertBenedictus）絨毛膜上皮主要由80％極化的UTC和20％非極化的TGC組成，UTC是一種單核立方上皮細胞，體積略大于肉阜處的上皮細胞，作為絨毛膜的主要組成細胞，他們侵襲入子宮肉阜，形成三個不同級別的微絨毛結(jié)構(gòu)，與此同時他們的形狀也變的不規(guī)則，以便于更好的貼合子宮肉阜[23,24]，增加胎兒胎盤與母體的接觸面積，即交換面積，如圖1.1所示。TGC是在奶牛妊娠的第16d由UTC增殖分化產(chǎn)生，而在整個妊娠過程中，約20%的滋養(yǎng)層細胞一直是TGC，主要是TGC會侵入子宮肉阜，并于該處上皮細胞融合，形成三核合胞體，如圖1.2所示，能為絨毛與肉阜的連接提供連接點，并且TGC本身能夠分泌一些激素，用以維持和幫助胚胎的發(fā)育。圖1.2滋養(yǎng)層細胞形成三核細胞（引自Dr.Wooding）Fig1.2GormationofatrinucleatecellbyTGC.(CourtesyofDr.Wooding)1.2.3滋養(yǎng)層細胞的作用UTC除了形成三級絨毛與肉阜結(jié)合外，其還參與了干擾素-τ（INF-τ）的產(chǎn)生[25]，干擾素-τ在母體識別中發(fā)揮關(guān)鍵作用，故其能夠保護及維持早期胚胎的正常發(fā)育。INF-τ的產(chǎn)生從妊娠開始一直持續(xù)，并且在妊娠的第17d含量最高，直至妊娠的第35d消失[25-28]。TGC在妊娠的第16d由UTC分化而來，其不僅能夠與肉阜上皮細胞融合，還能夠合

2奶牛體內(nèi)HSP27及其介導(dǎo)的細胞凋亡和氧化應(yīng)激通路關(guān)鍵因子變化與RFM相關(guān)性的研究212.1.2.2.3ELISA檢測血液中HSP27含量按照ELISA試劑盒說明書檢測血液中HSP27含量2.1.2.3氧化應(yīng)激途徑相關(guān)指標的檢測胎盤組織中GSH-Px以及G6PD活性以及GSSG和GSH含量的檢測依照說明書操作。2.1.3數(shù)據(jù)分析結(jié)果皆表示為平均數(shù)±SEM，使用SPSS20.0進行統(tǒng)計分析（單因素方差分析），qRT-PCR及WB結(jié)果用t檢驗分析，“*”為差異顯著（P<0.05），“**”為差異極顯著（P<0.01）。2.2實驗結(jié)果2.2.1ELISA實驗結(jié)果由圖2.1可知，RFM奶牛在產(chǎn)后12h，血液中HSP27濃度顯著高于NO-RFM奶牛（P<0.05）。圖2.1RFM奶牛與NO-RFM奶牛血清中HSP27濃度的檢測（R：RFM；N：NO-RFM）Fig2.1DetectionofHSP27inserumofRFMandNO-RFMcows（R：RFM；N：NO-RFM）NF-κBp65508233F：AGGAGCACGGACACCACCAAG164R；AGCTCAGCCTCATAGAAGCCATCCBad615013F：AGACTCCAGCCGTGCAGATAGG81R：GTTAGCCAGTGCTTGCTGAGACCBcl-xl282152F：GAGTCGGATCGCAACTTGGATGG188R：GCAGAACCACACCAGCCACAGBcl-2281020F：TGGATGACCGAGTACCTGAACCG132R：TGCCTTCAGAGACAGCCAGGAG

【參考文獻】：
期刊論文
[1]奶牛胎衣不下的發(fā)生原因、臨床癥狀及綜合防治措施[J]. 孫紹仁.  現(xiàn)代畜牧科技. 2020(01)
[2]奶牛胎衣不下防治探討[J]. 李紅玉.  中國畜禽種業(yè). 2018(05)
[3]奶牛胎衣不下的病因及治療[J]. 劉新,李金容,魯必均.  中國畜牧獸醫(yī)文摘. 2018(01)
[4]奶牛胎衣不下病因分析及防治措施[J]. 謝化弟,徐光明.  畜禽業(yè). 2008(08)



本文編號：3583999