水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus, RGDV）是呼腸孤病毒科（Reoviridae）植物呼腸孤病毒屬（Phytoreovirus）的一個(gè)成員,在寄主植物和介體昆蟲細(xì)胞內(nèi)都能進(jìn)行有效的增殖,由介體電光葉蟬和黑尾葉蟬以持久增殖型方式傳播。其基因組編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（P1、P2、P3、P5、P6和P8）和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（Pns4、 Pns7、Pns、Pns10、Pns11和Pns12）。本文利用草地貪夜蛾細(xì)胞（Spodoptera frugiperda, Sf9）和電光葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞體系,對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白Pns7、Pns9、Pns12及結(jié)構(gòu)蛋白P8進(jìn)行了功能研究。為了明確RGDV的病毒原質(zhì)形成機(jī)制,本研究通過異源表達(dá)體系分析Pns7、Pns9和Pns12在Sf9細(xì)胞內(nèi)的定位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pns7和Pns9定位在細(xì)胞質(zhì)中,而Pns12定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。將三個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白分別進(jìn)行兩兩共定位,發(fā)現(xiàn)Pns7和Pns9能夠共定位在細(xì)胞質(zhì)中,而Pns7和Pnsl2未出現(xiàn)共同定位在細(xì)胞內(nèi)的情況,仍與單獨(dú)表達(dá)的情況相似；當(dāng)Pns9和Pns12共表達(dá)時(shí),發(fā)現(xiàn)Pns9可以招募定位于細(xì)胞核的P... 

【文章來源】：福建農(nóng)林大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1. 前言
    1.1 水稻瘤矮病毒的研究概況
        1.1.1 水稻瘤矮病
        1.1.2 水稻瘤矮病毒粒體結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)
        1.1.3 RGDV基因組及蛋白功能的研究
        1.1.4 RGDV的傳播介體
    1.2 植物呼腸孤病毒在介體內(nèi)復(fù)制和裝配的研究
    1.3 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用
        1.3.1 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)
        1.3.2 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用
    1.4 Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)
        1.4.1 Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的原理
        1.4.2 Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用
    1.5 RNAi原理及其應(yīng)用
        1.5.1 RNAi原理
        1.5.2 RNAi的應(yīng)用
    1.6 本研究的目的和意義
2. RGDV非結(jié)構(gòu)蛋白Pns7、Pns9、Pns12的功能研究
    2.1 材料
        2.1.1 RGDV毒株和電光葉蟬
        2.1.2 菌株、培養(yǎng)細(xì)胞和載體
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑、藥品和實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 方法
        2.2.1 Bacmid DNA重組穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.1.1 水稻病葉總RNA的提取
            2.2.1.2 RGDVIns7、Pns9和Pns12基因的擴(kuò)增
            2.2.1.3 RGDVPns7、Pns9和Pns12目的基因DNA片段的回收
            2.2.1.4 RGDVPns7、Pns9和Pns12目的基因連接pMD18-T克隆載體
            2.2.1.5 目的基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞
            2.2.1.6 質(zhì)粒的提取與陽性克隆鑒定
            2.2.1.7 質(zhì)粒的雙酶切鑒定
            2.2.1.8 目的基因與表達(dá)載體pFastBacl的連接
            2.2.1.9 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac
            2.2.1.10 Bacmid DNA重組穿梭質(zhì)粒的提取
            2.2.1.11 Bacmid DNA重組穿梭質(zhì)粒的PCR檢測(cè)
        2.2.2 Bacmid DNA重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞
            2.2.2.1 Sf9培養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備
            2.2.2.2 Sf9培養(yǎng)細(xì)胞侵染上清液的制備
            2.2.2.3 免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)Pns7、Pns9和Pns12的表達(dá)
        2.2.3 雙鏈的合成
        2.2.4 免疫熒光標(biāo)記檢測(cè)dsPns7、dsPns9、dsPns12對(duì)RGDV侵染的影響
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 RGDV Pns7、Pns9和Pns12基因片段的擴(kuò)增
        2.3.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定
        2.3.3 RDGV Pns7、Pns9和Pns12在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)
        2.3.4 RGDV Pns7、Pns9和Pns12片段dsRNAs的合成
        2.3.5 dsRNAs對(duì)RGDV在電光葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的影響
    2.4 討論
3. RGDV外殼蛋白P8的功能研究
    3.1 材料
    3.2 方法
        3.2.1 目的基因片段dsRNAs的合成
        3.2.2 電光葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞VCMs的培養(yǎng)
        3.2.3 病毒侵染液的制備
        3.2.4 免疫熒光標(biāo)記檢測(cè)dsP8對(duì)RGDV侵染的影響
        3.2.5 病毒基因組dsRNAs的提取與檢測(cè)
        3.2.6 Western blot檢測(cè)dsRNA處理細(xì)胞對(duì)病毒編碼蛋白的影響
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 P8和GFP片段dsRNAs的合成
        3.3.2 dsRNAs對(duì)RGDV在介體培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)裝配的影響
        3.3.3 dsP8對(duì)病毒基因組復(fù)制的影響
        3.3.4 dsP8對(duì)RGDV蛋白表達(dá)的影響
    3.4 討論
4. 小結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄1 所用主要試劑及緩沖液的配置
附錄2 載體圖譜
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]重組人凝血因子Ⅷ在昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的分泌表達(dá)及鑒定[J]. 孫夏瑜,李杰,武堅(jiān)銳,周巖,郭躍貞.  中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志. 2014(07)
[2]蘋果蠹蛾顆粒體病毒（CpGV）GP37蛋白在Bac-to-Bac系統(tǒng)中的表達(dá)和亞細(xì)胞定位[J]. 劉向陽,孫修煉,張忠信,周琳.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2014(05)
[3]昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)登革2型病毒prM/E蛋白[J]. 劉曉宇,姚立紅,陳愛珺,郭建強(qiáng),張智清,陳輝.  中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備. 2014(05)
[4]Trizol試劑法快速高效提取3種作物不同組織總RNA[J]. 吳凱朝,黃誠(chéng)梅,李楊瑞,楊麗濤,吳建明.  南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2012(12)
[5]利用昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人乳頭瘤病毒16/18/33/58亞型L1蛋白[J]. 江為,靳彥文,劉萱,曹誠(chéng).  生物技術(shù)通訊. 2012(04)
[6]利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶中表達(dá)人生長(zhǎng)素[J]. 付凡,陳蔚,唐順明,汪生鵬,黃金山,趙巧玲,沈興家.  蠶業(yè)科學(xué). 2011(02)
[7]水稻瘤矮病毒S12編碼第2個(gè)RNA沉默抑制子[J]. 吳建國(guó),王春政,杜振國(guó),蔡麗君,胡梅群,吳祖建,李毅,謝聯(lián)輝.  中國(guó)科學(xué):生命科學(xué). 2011(01)
[8]昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)及應(yīng)用[J]. 閆玉濤,賀莉芳,劉暉,李曉飛,劉流,晏容,姚奎.  醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制. 2010(08)
[9]水稻瘤矮病毒基因組第11片段編碼一個(gè)RNA沉默抑制子[J]. 劉福秀,趙芹,阮小蕾,何云蔚,李華平.  科學(xué)通報(bào). 2008(01)
[10]昆蟲細(xì)胞系的培養(yǎng)和建立技術(shù)[J]. 張寰,張永安,秦啟聯(lián),王玉珠,曲良建,李瑄,苗麟,殷珍仙,張愛君,溫發(fā)園.  昆蟲學(xué)報(bào). 2007(08)

博士論文
[1]水稻瘤矮病毒病毒樣顆粒組裝及Pns12蛋白的亞細(xì)胞定位[D]. 范國(guó)成.福建農(nóng)林大學(xué) 2008



本文編號(hào)：3566108