本文關(guān)鍵詞：漳州水仙開花及花色基因植物表達載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：中國水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)屬石蒜科水仙屬,屬于法國多花水仙的變種,主要生產(chǎn)在上海、浙江、福建等地,其中以漳州水仙最有名,是、一類觀賞價值非常高的經(jīng)濟植物。三倍體的中國水仙,難以自然育種或是通過人工雜交產(chǎn)生新的品種。品種單一、繁殖速度有限、病毒積累導致品質(zhì)下降和品種退化等問題已大大阻礙了中國水仙的發(fā)展。因此,開展開中國水仙新品種培育和品種改良的工作意義重大。隨著分子生物學的崛起和植物基因工程等技術(shù)的發(fā)展,為中國水仙新品種的培育提供了新的方法。本研究以漳州水仙為材料,克隆出開花時間調(diào)節(jié)基因AP1、FT,并構(gòu)建了植物表達載體pCAMBIA1301-NtFT、 pCAMBIA1301-NtAP1、pC2300-35S-NtFT-OCS 和 pC2300-35S-NtAP1-OCS,以農(nóng)桿菌為介導轉(zhuǎn)化煙草和漳州水仙,獲得了31株的轉(zhuǎn)基因煙草和3株抗性水仙幼苗。同時克隆出花色形成類黃酮代謝途徑中關(guān)鍵基因FLS和ANS,構(gòu)建了植物表達載體pC2300-35S-NtANS-OCS、pBI121-FLS RNAi,并分別注射到水仙花瓣和副冠中進行瞬時表達,觀察到水仙花瓣和副冠顏色均發(fā)生了變化。研究結(jié)果將為開發(fā)中國水仙早花新品種和改良花色提供技術(shù)基礎(chǔ)和理論參考。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：1、提取漳州水仙花蕾和葉片的RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,并以此為模板,根據(jù)已發(fā)表的水仙的FT、AP1、FLS, ANS基因的全長序列設(shè)計特異性引物,利用常規(guī)PCR技術(shù)分別克隆出中國水仙中控制開花時間的關(guān)鍵基因FT、API和類黃酮途徑中關(guān)鍵基因FLS、ANS。分別構(gòu)建了植物表達載體pCAMBIA1301-NtFT、 pCAMBIA1301-NtAP1、pC2300-35S-NtANS-OCS、pC2300-35S-NtFT-OCS、 pC2300-35S-NtAP1-OCS 和 pBI121-FLSRNAi.農(nóng)桿菌介導構(gòu)建好的pC2300-35S-NtFT-OCS 和 pC2300-35S-NtAP1-OCS載體轉(zhuǎn)化到煙草中,pCAMBIA1301-NtFT 和 pCAMBIA1301-NtAPl載體轉(zhuǎn)化到漳州水仙中。2、以農(nóng)桿菌介導的NtAPl和NtFT載體轉(zhuǎn)化煙草,獲得了轉(zhuǎn)基因煙草植株,用PCR 和 Real-time quantitative PCR進行了檢測,證明所獲得植株為轉(zhuǎn)基因植株。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草植株的花期均比非轉(zhuǎn)基因的要提前10天左右,在表型上發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株均比非轉(zhuǎn)基因植株瘦弱矮小。3.以農(nóng)桿菌介導pCAMBIA1301-NtFT和pCAMBIA1301-NtAP1載體轉(zhuǎn)化了漳州水仙,初步獲得了3株抗性幼苗。4.首先用GUS基因建立漳州水仙花瓣和副冠中農(nóng)桿菌介導瞬時表達技術(shù)體系,結(jié)果表明此方法可以應用在水仙花瓣和副冠中。將構(gòu)建好的pC2300-35S-NtANS-OCS、pB1121-NtFLSRNAi 和 pSAK277-MdMYB10(本實驗室保存)載體以農(nóng)桿菌介導導入漳州水仙的花瓣和副冠中進行瞬時表達,初步觀察到水仙花瓣和副冠中顏色發(fā)生了改變。
【關(guān)鍵詞】：中國水仙 植物表達載體 RNAi 遺傳轉(zhuǎn)化 瞬時表達
【學位授予單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S682.21
【目錄】：

• 縮略詞10-11
• 摘要11-13
• Abstract13-15
• 第一章 前言15-21
• 1 調(diào)控花期基因研究進展15-17
• 1.1 分生組織特異基因API的研究進展16
• 1.2 植物開花基因FT的研究進展16-17
• 2 花卉花色基因工程研究進展17-19
• 2.1 植物類黃酮生物合成及調(diào)控研究進展17-18
• 2.2 黃酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)18
• 2.3 花青素合成酶(anthocyanidin sythase,ANS)18
• 2.4 類黃酮合成相關(guān)調(diào)控基因18-19
• 3 RNAi技術(shù)研究進展19
• 4 水仙遺傳轉(zhuǎn)化研究進展19-20
• 4.1 瞬時表達研究進展20
• 5 本研究科學意義20-21
• 第二章 中國水仙NtFT、NtAP1、NtANS植物表達載體的構(gòu)建21-33
• 1 材料21
• 1.1 載體和菌株21
• 1.2 試劑21
• 2 實驗方法21-24
• 2.1 引物的設(shè)計和合成21-22
• 2.2 NtAP1、NtFTF和NtANS基因cDNA全長序列的克隆22-23
• 2.3 目的片段的回收23
• 2.4 目的基因連接轉(zhuǎn)化與測序23
• 2.5 質(zhì)粒提取23
• 2.6 質(zhì)粒酶切23-24
• 2.7 質(zhì)粒連接反應24
• 2.8 重組質(zhì)粒的鑒定24
• 3 NtAP1基因植物表達載體構(gòu)建路線24-25
• 4 NtFT基因植物表達載體構(gòu)建路線25
• 5 NtANS基因植物表達載體構(gòu)建路線25-26
• 6 結(jié)果與分析26-32
• 6.1 NtAP1、NtFT和NtANS基因PCR擴增結(jié)果26
• 6.2 重組質(zhì)粒pC2300-35S-NtAPl-OCS構(gòu)建結(jié)果26-27
• 6.3 重組質(zhì)粒 pCAMBIA1301-35S-NtAPl-OCS 構(gòu)建結(jié)果27-29
• 6.4 重組質(zhì)粒pC2300-35S-NtFT-OCS構(gòu)建結(jié)果29-30
• 6.5 重組質(zhì)粒 pCAMBIA1301-35S-NtFT-(9G5 構(gòu)建結(jié)果30-31
• 6.6 重組質(zhì)粒pC2300-35S-NtANS-OCS構(gòu)建結(jié)果31-32
• 7 討論32-33
• 第三章 NtFLS RNAi植物表達載體的構(gòu)建33-43
• 1 試驗材料33
• 1.1 植物材料33
• 1.2 主要試劑33
• 2 試驗方法33-39
• 2.1 總RNA的提取及cDNA合成35
• 2.2 正反義NtFLS片段的克隆35-36
• 2.3 目的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌及測序36
• 2.4 NtFLSRNAi植物表達載體的構(gòu)建36-39
• 2.4.1 pKB-NtFLSRNAi雙價植物表達載體的構(gòu)建方法36-38
• 2.4.1.1 pKAN-NtFLS載體構(gòu)建38
• 2.4.1.2 pKAN-NtFLSRNAi載體構(gòu)建38
• 2.4.2 pB1121-NtFLSRNAi雙價植物表達載體的構(gòu)建38-39
• 3 結(jié)果與分析39-43
• 3.1 NtFLS正義及反義片段的PCR擴增結(jié)果39
• 3.2 pKAN-NtFLSRNAi載體的構(gòu)建結(jié)果39
• 3.3 pB1121-NtFLSRNAi表達載體的構(gòu)建結(jié)果39-43
• 第四章 NtAP1、NtFT轉(zhuǎn)化煙草43-58
• 1 試驗材料43-44
• 1.1 引物43
• 1.2 主要試劑及儀器43-44
• 1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件44
• 2 試驗方法44-46
• 2.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌44
• 2.1.1 含重組質(zhì)粒的大腸桿菌活化培養(yǎng)及質(zhì)粒提取44
• 2.2 活化根癌農(nóng)桿菌及制備感受態(tài)細胞44-45
• 2.2.1 根癌農(nóng)桿菌的活化44-45
• 2.2.2 根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備45
• 2.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌45
• 2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌后的鑒定45-46
• 2.3.1 重組質(zhì)粒酶切鑒定45-46
• 3 煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化46
• 3.1 最適合誘導芽培養(yǎng)基的確定46
• 3.2 抗生素最適選擇壓的確定46
• 4 根癌農(nóng)桿菌介導的NtAP1基因與NtFT基因分別轉(zhuǎn)化煙草46-47
• 4.1 無菌煙草幼苗的培養(yǎng)46-47
• 4.1.1 外植體的預培養(yǎng)46-47
• 4.2 農(nóng)桿菌侵染液的制備47
• 5 將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染煙草葉片步驟47
• 5.1 預培養(yǎng)47
• 5.2 共培養(yǎng)47
• 5.3 脫菌及選擇培養(yǎng)47
• 5.4 生根培養(yǎng)47
• 5.5 組培苗的煉苗和移栽47
• 6 轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR檢測47-48
• 7 轉(zhuǎn)基因煙草植株主要植物學性狀的觀測48
• 8 轉(zhuǎn)基因煙草植株RT-PCR檢測48
• 9 轉(zhuǎn)基因煙草植株的QPCR檢測48-49
• 9.1 轉(zhuǎn)基因煙草植株RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄48-49
• 10 結(jié)果與分析49-56
• 10.1 轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株鑒定結(jié)果49-51
• 10.2 煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化51
• 10.3 煙草轉(zhuǎn)化結(jié)果51-52
• 10.4 轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR檢測結(jié)果52-53
• 10.5 轉(zhuǎn)基因煙草植株RT-PCR檢測結(jié)果53-54
• 10.6 抗性植株的實時熒光定量PCR檢測結(jié)果54-55
• 10.6.1 抗性煙草植株的RNA提取結(jié)果54-55
• 10.7 轉(zhuǎn)基因煙草植株主要植物學性狀的觀測結(jié)果55-56
• 11 討論56-58
• 第五章 NtAPl、iWiT轉(zhuǎn)化潭州水仙58-64
• 1 試驗材料58-59
• 1.1 植物材料58
• 1.2 根癌農(nóng)桿菌和質(zhì)粒58
• 1.3 主要試劑58
• 1.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件58-59
• 2 試驗方法59
• 2.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌59
• 2.1.1 含重組質(zhì)粒的大腸桿菌活化培養(yǎng)及質(zhì)粒提取59
• 2.2 根癌農(nóng)桿菌的活化及感受態(tài)細胞的制備59
• 2.2.1 根癌農(nóng)桿菌EHA105的活化59
• 2.2.2 根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞的制備59
• 2.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌59
• 2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌后的鑒定59
• 2.3.1 重組質(zhì)粒酶切鑒定59
• 3 根癌農(nóng)桿菌介導的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化漳州水仙59
• 3.1 漳州水仙花亭的消毒與接種59
• 3.2 農(nóng)桿菌侵染液的制備59
• 4 轉(zhuǎn)化步驟59-60
• 4.1 預培養(yǎng)59
• 4.2 共培養(yǎng)59-60
• 4.3 延遲篩選培養(yǎng)60
• 4.4 篩選培養(yǎng)60
• 4.5 抗性芽的增殖培養(yǎng)60
• 4.6 生根培養(yǎng)60
• 5 結(jié)果與分析60-63
• 5.1 轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株鑒定結(jié)果60-62
• 5.2 水仙花葶轉(zhuǎn)化結(jié)果62-63
• 6 討論63-64
• 第六章 農(nóng)桿菌介導的水仙花瓣與副冠瞬時表達64-69
• 1 試驗材料64-65
• 1.1 植物材料64
• 1.2 根癌農(nóng)桿菌和質(zhì)粒64
• 1.3 主要試劑和儀器64-65
• 2 試驗方法65-66
• 2.1 表達載體分別轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌65
• 2.2 農(nóng)桿菌滲透液制備65
• 2.3 注射方案65
• 2.4 根癌農(nóng)桿菌注射法介導的瞬時表達系統(tǒng)的建立65-66
• 3 結(jié)果與分析66-67
• 4 討論67-69
• 參考文獻69-76
• 附錄：圖版和圖版說明76-78
• 致謝78

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  本文關(guān)鍵詞：漳州水仙開花及花色基因植物表達載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：354381