本文關鍵詞：鴨疫里默氏菌ragB基因的生物信息學分析和克隆表達，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：鴨疫里默氏菌(Riemerella antipestifer, RA)是一種能引起鴨、鵝、火雞等多種禽類發(fā)生急性或者慢性敗血性經(jīng)過的接觸性傳染病的感染病原。該病是目前阻礙養(yǎng)鴨業(yè)生產(chǎn)的重要疾病之一。本研究通過生物信息學分析血清1型RA基因組序列比對出RA CH-1株的受體抗原B蛋白基因ragB (Genbank登錄號：CP003787.1),選擇pET-32a(+)原核表達載體對該基因進行克隆表達,主要結果如下：1 RA ragB基因的生物信息學分析RA ragB基因全長1593bp, G+C含量為35.72%。該基因含有一個ORF,即ORF1593。密碼子有效數(shù)(effective number of codons, ENC)為38.491,稀有密碼子個數(shù)為43,含有3個密碼子二聯(lián)體(AGAATA、AGAAGA、ATA ATA)但不含有連續(xù)的2個以上的稀有密碼子串。密碼子偏愛性分析結果顯示該基因的偏嗜密碼子中,其第三位堿基大多為T堿基(8個)或者A堿基(12個)。RA ragB基因有25個密碼子的使用頻率與大腸桿菌的密碼子使用頻率具有顯著差異；有26個密碼子與酵母菌密碼子使用頻率具有顯著差異；有30個密碼子與人的密碼子使用頻率具有顯著差異。所以優(yōu)先選擇大腸桿菌原核表達系統(tǒng)作為RA RagB蛋白的異源表達系統(tǒng)。RA RagB蛋白由530個氨基酸編碼大小為58.97 kDa的蛋白,等電點(pI)為5.716。該蛋白有信號肽切割位點,沒有跨膜區(qū),抗原表位主要集中在60-77、186～201、251-269、387～403、495～513位氨基酸。蛋白功能位點預測：有N-糖基化位點2個(16、450),蛋白激酶C磷酸化位點5個(110、147、273、303、474),酪蛋白激酶II磷酸化位點3個(20、373、399), N-豆蔻酰化位點9個(56、73、319、328、334、393、445、473、496),酪氨酸激酶磷酸化位點2個(255、438),cAMP和cGMP依賴性位點1個(255)。亞細胞定位分析該蛋白主要分布于細胞膜上。氨基酸進化樹分析表明該蛋白與黃桿菌科編碼RagB蛋白的其它成員相似性較低。2 RA ragB基因的克隆表達用Oligo7.1對RA ragB基因設計了一對PCR引物,擴增片段大小為1623 bp,構建pMD19-T-ragB克隆載體,鑒定正確后再雙酶切與表達質粒連接構建pET-32a-ragB原核表達質粒,將表達質粒轉入表達菌株E.coli BL21內,在37℃,終濃度為0.8mmol/L的IPTG誘導10h的條件下重組蛋白能夠大量表達。經(jīng)SDS-PAGE分析蛋白大小約80 kDa,免疫印跡Western blot檢測該蛋白可被兔抗RA CH-1陽性血清識別,表明該蛋白具有很好的反應原性。
【關鍵詞】：鴨疫里默氏菌 ragB基因 生物信息學分析 原核表達
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 中文摘要3-4
• Abstract4-6
• 英文縮寫詞匯及其含義說明6-9
• 第一部分 序言9-14
• 1 RA研究概況9
• 2 RagB基因的研究進展9-13
• 3 研究的目的和意義13-14
• 第二部分 試驗內容14-43
• 1 材料14-17
• 1.1 菌株、菌種、質粒14
• 1.2 試劑14
• 1.3 主要溶液的配制14-16
• 1.3.1 培養(yǎng)基的配制14-15
• 1.3.2 DNA提取相關試劑的配制15
• 1.3.3 核酸電泳相關試劑的配制15
• 1.3.4 抗生素及其培養(yǎng)基的配制15
• 1.3.5 SDS-PAGE相關試劑的配制15-16
• 1.3.6 Western blot相關試劑的配制16
• 1.4 主要儀器設備16-17
• 2 方法17-23
• 2.1 鴨疫里默氏菌ragB基因的生物信息學分析17-18
• 2.1.1 RAragB基因的核苷酸序列分析17
• 2.1.2 RAragB基因的密碼子偏愛性分析17-18
• 2.1.3 RARagB蛋白質的組分分析18
• 2.2 RA ragB基因原核表達18-23
• 2.2.1 RAragB基因擴增18-19
• 2.2.2 重組T克隆質粒pMD19-T-ragB的構建及鑒定19-20
• 2.2.3 原核表達質粒pET-32a-ragB的構建和鑒定20-21
• 2.2.4 重組表達質粒pET-32a-ragB表達菌的誘導表達及條件優(yōu)化21-22
• 2.2.5 表達蛋白的Western-blot鑒定22-23
• 3 結果23-40
• 3.1 鴨疫里默氏菌ragB基因的生物信息學分析23-36
• 3.1.1 RA ragB核苷酸序列分析23
• 3.1.2 RA ragB基因的密碼子偏愛性分析23-30
• 3.1.3 RA RagB蛋白質的組分分析30-31
• 3.1.4 信號肽切割位點和跨膜區(qū)預測31
• 3.1.5 抗原性和疏水性分析31-33
• 3.1.6 功能位點預測33-34
• 3.1.7 蛋白質亞細胞定位分析34
• 3.1.8 二級結構預測與密碼子氨基酸序列保守結構域預測34-36
• 3.2 RA ragB基因的克隆表達及Western blot檢測36-40
• 3.2.1 RA ragB基因的擴增36
• 3.2.2 重組T克隆質粒pMD19-T-ragB的構建及鑒定36
• 3.2.3 原核表達質粒pET-32a-ragB的構建和鑒定36-37
• 3.2.4 RagB重組蛋白的誘導表達37-39
• 3.2.5 RagB重組蛋白的Western blot檢測39-40
• 4 討論40-43
• 4.1 鴨疫里默氏菌ragB基因的生物信息學分析40-41
• 4.2 RA RagB基因的原核表達和Western blot檢測41-43
• 小結43-45
• 參考文獻45-49
• 致謝49-50
• 附錄 作者簡介及攻讀碩士學位期間論文發(fā)表50

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 曾顯成;;鴨疫里默氏菌的分離鑒定[J];福建畜牧獸醫(yī);2007年05期

2 艾地云;賈凡;荊汝頂;羅玲;廖永洪;邵華斌;楊峻;;鴨疫里默氏菌的分離鑒定[J];中國預防獸醫(yī)學報;2007年12期

3 劉穎,蘇敬良,劉文華,李云格;鴨疫里默氏菌的藥物敏感性檢測[J];中國獸醫(yī)雜志;2005年05期

4 蘇文良;郭玉璞;;鴨疫里默氏菌9型的分離與鑒定[J];中國獸醫(yī)雜志;2006年07期

5 楊曉輝;程龍飛;陳紅梅;施少華;傅光華;萬春和;黃瑜;;血清11型鴨疫里默氏菌的分離鑒定[J];中國農(nóng)學通報;2012年05期

6 田令;湯承;岳華;;四川地區(qū)鴨疫里默氏菌的耐藥表型分析[J];西南民族大學學報(自然科學版);2010年01期

7 楊曉輝;程龍飛;陳紅梅;黃瑜;;鴨疫里默氏菌分子生物學研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2012年04期

8 劉傳華;趙艷麗;王玉海;麻水利;;鴨疫里默氏菌研究進展[J];動物醫(yī)學進展;2008年05期

9 李發(fā)蘭;孫昌艷;張德軍;;鴨疫里默氏菌的研究進展[J];畜禽業(yè);2008年08期

10 程龍飛,李文楊,施少華,傅光華,彭春香,黃瑜;鴨疫里默氏菌基因分型[J];中國獸醫(yī)學報;2004年06期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 程龍飛;陳紅梅;傅光華;施少華;萬春和;傅秋玲;黃瑜;林建生;;11型鴨疫里默氏菌的主要生物學特性分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學術研討會論文集[C];2013年

2 張起泉;;鴨發(fā)生鴨疫里默氏菌病的診療報告[A];福建省畜牧獸醫(yī)學會2009年學術年會論文集[C];2009年

3 王騰;紀麗麗;王淑俠;韓相敏;李爽;章麗嬌;宋金成;蘇文良;何偉勇;蘇敬良;;鴨疫里默氏菌基因分型研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十六次學術研討會論文集[C];2012年

4 王慧強;白如念;楊秀環(huán);王勇月;蘇敬良;;種鴨鴨疫里默氏菌性關節(jié)炎診斷[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十六次學術研討會論文集[C];2012年

5 劉文博;張秀紅;羊科;彭大新;張如寬;;鵝并發(fā)鴨疫里默氏菌病和大腸桿菌病的診斷[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十一次學術研討會論文集[C];2002年

6 劉文華;蘇敬良;劉穎;許秀梅;金鑫;吳培福;;16S rRNA基因分析在鴨疫里默氏菌鑒定中的應用[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第六屆理事會第二次會議暨教學專業(yè)委員會第六屆代表大會論文集[C];2006年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 福建省長泰縣畜牧獸醫(yī)站 劉長木;番鴨細小病毒病與鴨疫里默氏菌病混合感染的診治[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報;2006年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 羅洪艷;鴨疫里默氏菌CH-1株脂多糖合成相關基因lpsA的功能研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2015年

2 袁彪;鴨疫里默氏菌莢膜多糖輸出外膜蛋白wza基因缺失株的構建及功能研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2015年

3 楊思思;鴨疫里默氏菌ragB基因的生物信息學分析和克隆表達[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2015年

4 李清竹;血清1型鴨疫里默氏菌OmpA/MotB蛋白免疫原性初探[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2015年

5 劉悸斌;鴨疫里默氏菌GroEL和GroES蛋白生物活性及不同應激條件對其表達量的影響[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2015年

6 雷紅宇;實驗性鴨疫里默氏菌病病理學研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2001年

7 程龍飛;福建省鴨疫里默氏菌病防制研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2005年

8 劉穎;鴨疫里默氏菌耐藥性監(jiān)測與分析[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2005年

9 王艷;鴨疫里默氏菌制苗菌株篩選及大罐發(fā)酵培養(yǎng)工藝條件優(yōu)化[D];吉林大學;2013年

10 潘海城;一株鴨疫里默氏菌部分生物學特性分析[D];福建農(nóng)林大學;2010年

  本文關鍵詞：鴨疫里默氏菌ragB基因的生物信息學分析和克隆表達，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：354004