本文關(guān)鍵詞：禾谷孢囊線蟲新效應(yīng)因子Ha-G20E03基因克隆及用于研究其功能的新模式系統(tǒng)的探索，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：禾谷孢囊線蟲是世界上廣泛分布的一種重要植物病原,給小麥糧食生產(chǎn)安全造成了嚴(yán)重威脅。植物線蟲通過其口針向寄主植物細(xì)胞分泌效應(yīng)子蛋白,從而促進(jìn)線蟲寄生和引起植物致病。但是迄今為止,有關(guān)于禾谷孢囊線蟲效應(yīng)子分子機(jī)制研究還十分膚淺,這主要是因為其研究缺乏一個合適的病害系統(tǒng)。本實驗首先基于轉(zhuǎn)錄組文庫數(shù)據(jù),利用RACE法克隆一個推定效應(yīng)子基因c DNA全長。該基因全長837bp,其中包含一個585bp的開放閱讀框,編碼194個氨基酸,在N端擁有一個21個氨基酸的信號肽,且不含跨膜結(jié)構(gòu)域。通過BLAST比對發(fā)現(xiàn),該基因與大豆孢囊線蟲G20E03擁有90%的同源性,因此我們將其命名為Ha-G20E03基因。通過原位雜交實驗,Ha-G20E03基因在禾谷孢囊線蟲食道腺細(xì)胞中特異性表達(dá),可能在禾谷孢囊線蟲寄生過程中起到重要作用。為了更好的研究該基因的功能,本實驗選取了二穗短柄草,二倍體小麥2A和2D作為候選的禾本科模式植物,希望建立用來替代小麥來研究禾谷孢囊線蟲和其寄主互作分子機(jī)制的模式系統(tǒng)。通過禾谷孢囊線蟲接種實驗,活性氧ROS含量檢測,q RT-PCR,植物根部組織組織學(xué)分析,大麥條斑花葉病毒誘導(dǎo)的基因沉默(BSMV-VIGS)在候選禾本科植物上的應(yīng)用等技術(shù)檢測了禾谷孢囊線蟲與3種候選禾本科模式植物的親和性,并對非親和寄主分析可能原因,以及對親和寄主進(jìn)行了接下來的沉默實驗。研究結(jié)果表明:禾谷孢囊線蟲可以侵入到Bd21-3根部,但不能完成其生活史,并發(fā)現(xiàn)這種非親和性并不依賴于禾谷孢囊線蟲種群差異。此外,我們在接種禾谷孢囊線蟲后3天的二穗短柄草根組織中觀測到強(qiáng)烈的ROS迸發(fā),并發(fā)現(xiàn)在這個時間點有7個第三類氧化酶基因和2個NADPH氧化酶基因表達(dá)顯著上調(diào)。隨后,我們發(fā)現(xiàn)禾谷孢囊線蟲可以在二倍體小麥2A(G1812)和2D(AL8/78)中正常發(fā)育,完成生活史,且發(fā)育進(jìn)程、各蟲態(tài)所占比例與對照基本上一致。解剖學(xué)結(jié)果表明2D中的合胞體細(xì)胞稍小,2A中合胞體發(fā)育正常。在孢囊形成上,2A和對照的單株孢囊數(shù)相當(dāng),而2D的單株孢囊數(shù)稍低。在實驗室中,在小麥上建立大麥條斑花葉病毒誘導(dǎo)的基因沉默體系,成功將小麥靶標(biāo)基因PDS沉默,出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象,并確定了沉默效果最好的小麥品種濟(jì)麥22作為實驗室今后VIGS相關(guān)實驗寄主小麥。在二倍體小麥2A上建立大麥條斑花葉病毒誘導(dǎo)的基因沉默體系仍然在構(gòu)建中。本研究克隆了Ha-G20E03基因,并明確其在禾谷孢囊線蟲食道腺細(xì)胞中特異性表達(dá)。本實驗還明確了二穗短柄草是禾谷孢囊線蟲非寄主,無法作為與禾谷孢囊線蟲互作的模式寄主,并認(rèn)為ROS迸發(fā)是其不親和性重要原因之一,POX基因可能在其中起到關(guān)鍵作用。而二倍體小麥2A和2D均與禾谷孢囊線蟲親和,2A對禾谷孢囊線蟲更敏感,有更大的可能性作為研究禾谷孢囊線蟲和其寄主互作的模式寄主。本實驗結(jié)果將為禾谷孢囊線蟲與寄主互作分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：二穗短柄草 二倍體小麥2A和2D 活性氧(ROS) 病毒介導(dǎo)的基因沉默(VIGS) 禾本科模式植物 推定效應(yīng)子
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S432.45
【目錄】：

• 摘要6-7
• abstract7-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 引言13-23
• 1.1 植物寄生線蟲13
• 1.2 禾谷孢囊線蟲及其危害13-17
• 1.2.1 孢囊線蟲簡介13
• 1.2.2 小麥禾谷孢囊線蟲及其危害13-17
• 1.3 推定效應(yīng)子基因G20E03研究進(jìn)展17-18
• 1.3.1 植物線蟲效應(yīng)子研究進(jìn)展17
• 1.3.2 推定效應(yīng)子基因G20E03研究進(jìn)展17-18
• 1.4 禾本科模式作物研究進(jìn)展18-20
• 1.4.1 目前主要禾本科模式植物18-19
• 1.4.2 二倍體小麥 2A和 2D19-20
• 1.4.3 應(yīng)用于植物線蟲與寄主互作的模式平臺20
• 1.5 病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）研究進(jìn)展20-22
• 1.5.1 VIGS技術(shù)的建立、發(fā)展與應(yīng)用20-21
• 1.5.2 大麥條斑花葉病毒（BSMV）誘導(dǎo)的基因沉默21-22
• 1.6 研究目的及意義22-23
• 1.6.1 目的22
• 1.6.2 研究意義22-23
• 第二章 禾谷孢囊線蟲Heterodera avenae推定效應(yīng)子基因G20E03的克隆與定位分析23-38
• 2.1 實驗材料23
• 2.1.1 供試禾谷孢囊線蟲23
• 2.2 禾谷孢囊線蟲G20E03基因的全長克隆和定位分析23-33
• 2.2.1 禾谷孢囊線蟲G20E03基因的全長克隆23-30
• 2.2.2 禾谷孢囊線蟲G20E03基因的原位雜交30-33
• 2.3 結(jié)果與分析33-36
• 2.3.1 禾谷孢囊線蟲G20E03基因cDNA全長克隆33-35
• 2.3.2 禾谷孢囊線蟲G20E03基因序列分析35
• 2.3.3 禾谷孢囊線蟲G20E03基因原位雜交35-36
• 2.4 討論與小結(jié)36-38
• 第三章 禾谷孢囊線蟲Heterodera avenae對不同禾本科寄主的侵染研究38-50
• 3.1 實驗材料38
• 3.1.1 供試禾谷孢囊線蟲38
• 3.1.2 候選的禾本科寄主植物38
• 3.2 禾谷孢囊線蟲對二穗短柄草和二倍體小麥的侵染實驗38-42
• 3.2.1 溫室接種方法38-39
• 3.2.2 染色方法39
• 3.2.3 根組織內(nèi)線蟲形態(tài)觀察和數(shù)量統(tǒng)計39
• 3.2.4 植物根組織內(nèi)ROS含量的測定39-40
• 3.2.5 ROS產(chǎn)生相關(guān)基因的定量分析40-42
• 3.2.6 植物根組織中禾谷孢囊線蟲誘導(dǎo)的合胞體組織學(xué)分析42
• 3.3 結(jié)果與分析42-48
• 3.3.1 禾谷孢囊線蟲對二穗短柄草的侵染實驗42-44
• 3.3.2 二穗短柄草根組織中ROS含量測量和ROS產(chǎn)生基因表達(dá)分析44-47
• 3.3.3 禾谷孢囊線蟲對二倍體小麥 2A和 2D的侵染實驗47-48
• 3.4 討論與小結(jié)48-50
• 第四章 大麥條斑花葉病毒（BSMV）誘導(dǎo)二倍體小麥 2A基因有效沉默體系的探索50-58
• 4.1 實驗材料50
• 4.1.1 供試植物二倍體小麥 2A50
• 4.1.2 BSMV病毒載體50
• 4.1.3 本氏煙50
• 4.2 大麥條斑花葉病毒誘導(dǎo)基因沉默體系在二倍體小麥 2A的探索50-54
• 4.2.1 本氏煙種植和培養(yǎng)50-51
• 4.2.2 BSMV質(zhì)粒的提取51
• 4.2.3 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備51
• 4.2.4 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化51-52
• 4.2.5 BSMV誘導(dǎo)的基因沉默其過程52-54
• 4.2.6 實時定量PCR（Real-Time PCR）檢測54
• 4.3 結(jié)果與分析54-57
• 4.3.1 適合大麥條斑花葉病毒誘導(dǎo)基因沉默體系的小麥品種篩選54-56
• 4.3.2 大麥條斑花葉病毒誘導(dǎo)基因沉默體系在二倍體小麥 2A上的探索56-57
• 4.4 討論與小結(jié)57-58
• 第五章 全文結(jié)論58-60
• 參考文獻(xiàn)60-67
• 附錄67-68
• 致謝68-69
• 作者簡歷69

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 王振躍,王守正,李洪連,袁紅霞;河南省小麥孢囊線蟲病的初步研究[J];華北農(nóng)學(xué)報;1993年S1期

2 鄭經(jīng)武;林茂松;方中達(dá);;溫度對燕麥孢囊線蟲二齡幼蟲孵化及生活力的影響[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;1996年01期

3 侯生英;彭德良;王愛玲;黃文坤;耿貴工;張貴;;青海省小麥孢囊線蟲病調(diào)查初報[J];青海大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2008年05期

4 鄭經(jīng)武,程瑚瑞,方中達(dá);燕麥胞囊線蟲(Heterodera avenae Woll.)孵化特性研究[J];浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;1997年06期

5 陳品三,王明祖,彭德良;我國小麥禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae Wollenweber)的發(fā)現(xiàn)與鑒定初報[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);1991年05期

6 李秀花;馬娟;高波;王容燕;陳書龍;;燕麥孢囊線蟲在河北冬麥區(qū)的種群動態(tài)[J];植物保護(hù)學(xué)報;2013年04期

  本文關(guān)鍵詞：禾谷孢囊線蟲新效應(yīng)因子Ha-G20E03基因克隆及用于研究其功能的新模式系統(tǒng)的探索，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：347975