旋毛蟲（Trichinella spiralis）是一種典型的人獸共患寄生線蟲,其引發(fā)的旋毛蟲病是一種世界廣泛分布的食源性寄生蟲病。目前的診斷方法主要為集樣消化法和ELISA檢測方法。肌幼蟲排泄分泌產(chǎn)物（ES）為應(yīng)用最廣泛的診斷抗原,但具有期特異性且成分復雜。旋毛蟲相關(guān)蛋白可引發(fā)宿主Th2型免疫反應(yīng),造成宿主的免疫抑制,進而形成慢性感染導致長期寄生,現(xiàn)階段該反應(yīng)機理尚不清楚。旋毛蟲ES成分復雜,包含多種蛋白酶:絲氨酸蛋白酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶等。因此,旋毛蟲ES相關(guān)抗原分子的分離、鑒定及其抗原性和免疫調(diào)節(jié)性的研究對于旋毛蟲病免疫學檢測方法的建立及疫苗研制非常重要。本實驗室前期構(gòu)建了旋毛蟲3日齡成蟲的c DNA文庫,經(jīng)過免疫學方法篩選得到高豐度與強免疫反應(yīng)性的絲氨酸蛋白酶基因Ts-Sp-7（Gen Bank登錄號EU263332.1）。本研究基于該基因?qū)s-Sp-7蛋白抗原性及免疫調(diào)節(jié)性進行研究。參照Gen Bank公布的Ts-Sp-7基因序列,設(shè)計特異性引物,收取感染3天的旋毛蟲成蟲階段的總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲取目的序列,常規(guī)PCR擴增,并構(gòu)建原核... 

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【學位級別】：碩士

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Ts-Sp-7蛋白信號肽預(yù)測

第二篇第1章旋毛蟲Ts-Sp-7蛋白的表達與純化25圖1.3重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Ts-Sp-7的雙酶切鑒定Figure1.3DoubleenzymedigestionidentificationofthepET-28a(+)-Ts-Sp-7M.DNA分子質(zhì)量標準;1.重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物1.3.2目的基因的擴增提取總RNA后進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，作為模板進行目的基因的擴增。目的基因理論大小為1372bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增產(chǎn)物和目的條帶大小相對應(yīng)（圖1.2）。雖然存在非特異性條帶，但有間隔且含量較低，對之后的PCR產(chǎn)物回收不會有直接影響。測序結(jié)果也顯示該目的條帶序列正確。1.3.3重組質(zhì)粒雙酶切鑒定按照產(chǎn)物回收試劑盒操作步驟對擴增片段進行膠回收，之后酶切連接pET28a空載體，對重組的克隆載體進行雙酶切鑒定，通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可以看出，酶切片段大小與擴增產(chǎn)物大小相符（圖1.3），測序證實序列正確，因此，目的基因克隆載體構(gòu)建成功。圖1.2Ts-Sp-7基因PCR擴增Figure1.2PCRamplificationofTs-Sp-7geneM.DNAMarker；1.Ts-Sp-7基因的PCR產(chǎn)物

第二篇第1章旋毛蟲Ts-Sp-7蛋白的表達與純化261.3.4重組Ts-Sp-7蛋白的可溶性分析將驗證正確的重組質(zhì)粒pET28a-Ts-Sp-7轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細胞，并對其誘導表達，通過超聲破碎菌體，離心后分別取上清與包涵體沉淀進行可溶性分析，pET28a空載體誘導產(chǎn)物做對照。Ts-Sp-7蛋白理論分子量為47.5kDa，由SDS-PAGE結(jié)果可以看出，重組Ts-Sp-7蛋白作為包涵體進行表達，且大小與理論分子質(zhì)量切合（圖1.4），6h時表達量達到最高（圖1.5）。圖1.5目的蛋白的誘導表達Figure1.5TheinducedexpressionofthetargetproteinM.蛋白分子質(zhì)量標準；1.誘導前2-7.誘導1-6h圖1.4目的蛋白可溶性分析Figure1.4SDS-PAGEanalysisofexpressedproteinM.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1.pET-28a(+)空載體的誘導產(chǎn)物；2.pET-28a(+)-Ts-Sp-7誘導后超聲上清；3.pET-28a(+)-Ts-Sp-7誘導后超聲沉淀

【參考文獻】：
期刊論文
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[3]旋毛蟲重組蛋白谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶對小鼠骨髓源樹突狀細胞成熟和活化的影響[J]. 索佳文,劉蕾,徐凝,劉曉雷,劉明遠,白雪.  中國獸醫(yī)學報. 2018(03)
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博士論文
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[2]WN10蛋白生物學功能的研究及旋毛蟲病免疫學檢測方法的建立[D]. 唐斌.吉林大學 2015
[3]旋毛蟲不同發(fā)育時期抗原基因的篩選與鑒定[D]. 吳秀萍.吉林大學 2009

碩士論文
[1]上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析試紙條快速檢測豬旋毛蟲方法建立[D]. 王春.吉林大學 2019
[2]旋毛蟲組織蛋白酶B的克隆表達及在幼蟲侵入小鼠腸上皮細胞中的作用[D]. 韓月.鄭州大學 2019
[3]旋毛蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶對巨噬細胞和樹突狀細胞的免疫調(diào)節(jié)研究[D]. 索佳文.吉林大學 2018
[4]旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶對宿主免疫細胞影響的初步研究[D]. 于建立.吉林大學 2012
[5]旋毛蟲、偽旋毛蟲肌幼蟲cDNA文庫的構(gòu)建及其免疫學篩選[D]. 楊志東.吉林大學 2007



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