發(fā)布時間：2017-04-29 06:03

  本文關(guān)鍵詞：豬細小病毒感染PK-15細胞前后microRNAs表達譜的研究及部分免疫功能的鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬細小病毒(PPV)是引起母豬繁殖障礙性疾病的重要病原之一。此外,PPV還能引起仔豬腹瀉、皮炎以及呼吸系統(tǒng)疾病,在豬非化膿性心肌炎、豬消瘦綜合癥和仔豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥等疾病中也發(fā)揮著重要的作用。全球普遍存在著豬細小病毒病,嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展,對其造成了巨大的經(jīng)濟損失。MicroRNAs是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為19-24nt的單鏈RNA分子,其通過與靶基因mRNA 3'UTR相互作用,在病毒的侵染、細胞的增殖分化及凋亡、腫瘤的發(fā)生、體內(nèi)平衡等許多生物學(xué)過程中起著重要的調(diào)控作用。目前,關(guān)于細胞miRNAs調(diào)節(jié)病毒感染的研究已有報道,其中包括乙型腦炎病毒,豬繁殖與呼吸綜合癥病毒,丙型肝炎病毒,A型流感病毒,豬瘟病毒等,但對于PPV感染PK-15細胞誘導(dǎo)細胞miRNAs表達卻未見報道。為了探究細胞miRNAs在PPV感染中的作用,本試驗通過測定PPV的TCID50,在剛貼壁的PK-15細胞中按照1個MOI接種PPV,并于感染24h后對細胞進行總RNA的抽提,通過Solexa高通量測序方法篩選出符合要求的miRNAs,并對PPV感染前后細胞miRNAs的表達量進行測定。同時根據(jù)PPV NS1的保守序列設(shè)計了一對熒光定量檢測引物,建立了PPV熒光定量PCR方法。通過軟件預(yù)測能靶向PPV基因組的miRNAs,并將其與免疫有關(guān)的miRNAs共同轉(zhuǎn)染PK-15細胞,運用建立的熒光定量方法對其功能進行了驗證。通過Solexa高通量測序結(jié)果表明,共有476條miRNAs在PPV感染前后表達量有所改變,其中240條miRNAs是對照組數(shù)據(jù)庫所特有的,13條miRNAs是試驗組數(shù)據(jù)庫所特有的。對建立的細胞miRNAs表達譜進行分析發(fā)現(xiàn),共有182條miRNAs差異表達,其中60條miRNAs屬于上調(diào)表達,122條miRNAs屬于下調(diào)表達。miR-21是表達量最大的,而miR-10b是差異最大的。對差異表達的miRNAs的靶標進行預(yù)測發(fā)現(xiàn),C-JUN、MyD88、TLR7等與免疫有關(guān)的基因被預(yù)測出來,這結(jié)果表明這些差異表達的miRNAs可能參與PPV感染過程。通過實時熒光定量驗證了隨機挑選的10個差異表達的miRNAs,其結(jié)果全部與Solexa高通量測序結(jié)果致。所建立的熒光定量PCR最佳退火溫度為59℃,其在1.59×109-1.59×104copies/μL可得到較為理性的標準曲線,相關(guān)系數(shù)R2為0.997,擴增效率為97.2%,且其特異性和重復(fù)性都很好,能被運用于miRNAs 功能試驗的驗證。PPV基因組靶標預(yù)測結(jié)果顯示,miR-34a能靶向PPV NS1的編碼區(qū),且該編碼區(qū)在PPV病毒中屬于高度保守序列。熒光定量PCR結(jié)果顯示,miR-34a能抑制PPV的復(fù)制,而其他的miRNAs則不能,但其具體的抑制機制仍需要進一步的研究。本試驗成功構(gòu)建了豬PK-15細胞的小RNA數(shù)據(jù)庫,并建立了PPV感染前后細胞miRNAs的表達譜,對其差異表達的miRNAs及其靶標分析,有助于在miRNAs的層面上了解PPV感染機制以及宿主抗病毒免疫的分子機制。本試驗同時也證實了miR-34a能抑制豬細小病毒的復(fù)制,這為PPV的防治提供了一條新思路。
【關(guān)鍵詞】：豬細小病毒 miRNAs PK-15細胞 NS1基因
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略詞8-12
• 第一部分 文獻綜述及研究的目的與意義12-26
• 一 文獻綜述12-25
• 1 細小病毒概述12
• 2 豬細小病毒概述12-18
• 2.1 豬細小病毒的病原學(xué)12-14
• 2.2 豬細小病毒的分子生物學(xué)特性14-16
• 2.2.1 豬細小病毒的基因組結(jié)構(gòu)14-15
• 2.2.2 豬細小病毒的DNA復(fù)制15
• 2.2.3 豬細小病毒編碼的蛋白及功能15-16
• 2.2.4 豬細小病毒的致病機制16
• 2.3 豬細小病毒的流行病學(xué)16-17
• 2.4 豬細小病毒的防制17-18
• 3 MicroRNAs的概述18-23
• 3.1 MicroRNAs的發(fā)現(xiàn)18
• 3.2 MicroRNAs的合成18-19
• 3.3 MicroRNAs的作用機制19-20
• 3.4 MicroRNAs的研究方法20-21
• 3.5 microRNAs基因預(yù)測和靶基因預(yù)測21
• 3.6 MicroRNAs與免疫21-23
• 4 microRNAs在宿主-病毒中的作用23-25
• 二 研究的目的與意義25-26
• 第二部分 試驗部分26-54
• 第一章 PK-15細胞microRNAs數(shù)據(jù)庫的建立及與PPV有關(guān)的microRNAs的分析26-40
• 1 材料26-27
• 1.1 細胞及毒株26
• 1.2 主要試劑及儀器26
• 1.3 主要試劑的配置26-27
• 2 方法27-31
• 2.1 PK-15細胞的傳代培養(yǎng)27
• 2.2 TCID_(50)的測定27
• 2.3 PPV感染27
• 2.4 細胞總RNA的提取27-28
• 2.5 PK-15細胞microRNAs數(shù)據(jù)庫的建立28-29
• 2.5.1 細胞樣品RNA的提取及鑒定28
• 2.5.2 數(shù)據(jù)庫的建立及高通量測序28
• 2.5.3 miRNAs的篩選28-29
• 2.6 miRNAs熒光定量的驗證29-31
• 3 結(jié)果31-37
• 3.1 TCID_(50)檢測結(jié)果31-32
• 3.2 PPV感染PK-15細胞32
• 3.3 RNA樣品的檢測32-33
• 3.4 高通量測序結(jié)果統(tǒng)計33-35
• 3.5 差異表達的miRNAs及其靶基因的預(yù)測35-36
• 3.6 熒光定量驗證結(jié)果36-37
• 4 討論37-39
• 5 小結(jié)39-40
• 第二章 PPV熒光定量方法的建立及部分miRNAs功能驗證40-54
• 1 材料40-41
• 1.1 細胞、菌株及毒株40
• 1.2 生物試劑及器材40
• 1.3 主要試劑的配制40-41
• 2 方法41-45
• 2.1 PPV引物合成41
• 2.2 PPV DNA抽提41-42
• 2.3 標準質(zhì)粒的構(gòu)建42-43
• 2.3.1 熒光定量PCR擴增與產(chǎn)物的回收42
• 2.3.2 感受態(tài)細胞的制備42-43
• 2.3.3 連接與轉(zhuǎn)化43
• 2.3.4 質(zhì)粒的抽提與鑒定43
• 2.4 熒光定量PCR43-44
• 2.4.1 PPV熒光定量標準曲線的繪制43-44
• 2.4.2 重復(fù)性和特異性44
• 2.5 miRNAs靶標的預(yù)測與功能的驗證44-45
• 2.5.1 靶標的預(yù)測及miRNAs篩選44
• 2.5.2 轉(zhuǎn)染44-45
• 2.5.3 熒光定量檢測45
• 3 結(jié)果45-51
• 3.1 PPV熒光定量引物檢測45-46
• 3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建及測序46-47
• 3.3 熒光定量PCR標準曲線繪制47
• 3.4 熒光定量PCR重復(fù)性和特異性47-48
• 3.5 靶標預(yù)測與功能驗證48-51
• 4 討論51-52
• 5 小結(jié)52-54
• 參考文獻54-66
• 致謝66-67
• 附表67-80
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄80

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 ;Small but influential:the role of microRNAs on gene regulatory network and 3′UTR evolution[J];遺傳學(xué)報;2009年01期

2 B.SAILAJA;S.R.VOLETI;D.SUBRAHMANYAM;N.SARLA;V.VISHNU PRASANTH;V.P.BHADANA;S.K.MANGRAUTHIA;;Prediction and Expression Analysis of miRNAs Associated with Heat Stress in Oryza sativa[J];Rice Science;2014年01期

3 羅書芳;崔浪軍;王健;屈生憲;;干旱脅迫下15種丹參miRNAs差異表達分析[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年05期

4 郝力力;李必富;;應(yīng)用熒光定量PCR對細粒棘球絳蟲miRNAs在蟲體不同發(fā)育階段表達量的研究[J];中國農(nóng)學(xué)通報;2012年26期

5 Liming Ma;Lianghu Qu;;The Function of MicroRNAs in Renal Development and Pathophysiology[J];遺傳學(xué)報;2013年04期

6 Gang Wu;;Plant MicroRNAs and Development[J];Journal of Genetics and Genomics;2013年05期

7 Xiang-Shun Cui;Xing-Hui Shen;Shao-Chen Sun;Sun-Wha Cho;Young-Tae Heo;Yong-Kook Kang;Teruhiko Wakayama;Nam-Hyung Kim;;Identifying MicroRNA and mRNA Expression Profiles in Embryonic Stem Cells Derived from Parthenogenetic,Androgenetic and Fertilized Blastocysts[J];遺傳學(xué)報;2013年04期

8 葉瑞松;習(xí)欠云;束剛;王麗娜;王松波;朱曉彤;高萍;江青艷;張永亮;;GnRH引起豬垂體細胞miRNAs表達譜變化[J];畜牧與獸醫(yī);2012年S1期

9 陶新;徐子偉;;miRNAs對腸道健康的調(diào)控作用及機理[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2013年09期

10 郝力力;李銳;李必富;;細粒棘球絳蟲miRNAs的鑒定及分析[J];浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報;2012年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 ;A potential role for Chlamydomonas miRNAs in response to environmental changes[A];中國遺傳學(xué)會植物遺傳和基因組學(xué)專業(yè)委員會2009年學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2009年

2 Ping Xuan;Maozu Guo;Yangchao Huang;;MaturePred:Efficient Identification of MicroRNAs within Novel Plant Pre-miRNAs[A];第五屆全國生物信息學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2012年

3 Zhen-Dong Xiao;Li-Ting Diao;Jian-Hua Yang;Hui Xu;Mian-Bo Huang;Yong-Jin Deng;Hui Zhou;Liang-Hu Qu;;Systematical identification of cis-elements orchestrating the expressions of miRNAs in humans[A];生命的分子機器及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)——2012年全國生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)大會摘要集[C];2012年

4 ;Cell-free miRNAs may indicate diagnosis and docetaxel sensitivity of tumor cells in malignant effusions[A];2011醫(yī)學(xué)科學(xué)前沿論壇第十二屆全國腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

5 任波;馬迪;李毅;;地高辛標記探針結(jié)合化學(xué)發(fā)光技術(shù)快速靈敏檢測植物總RNA中的miRNAs方法[A];中國植物病理學(xué)會2005年學(xué)術(shù)年會暨植物病理學(xué)報創(chuàng)刊50周年紀念會論文摘要集[C];2005年

6 任波;馬迪;李毅;;地高辛標記探針結(jié)合化學(xué)發(fā)光技術(shù)快速靈敏檢測植物總RNA中的miRNAs方法[A];中國植物病理學(xué)會2005年學(xué)術(shù)年會暨植物病理學(xué)報創(chuàng)刊50周年紀念會論文集[C];2005年

7 戚鵬;韓金祥;魯艷芹;王傳璽;欒中華;卜范峰;;病毒編碼的miRNAs:基因表達新的調(diào)控因子[A];山東省藥學(xué)會2006年生化與生物技術(shù)藥物學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

8 ;Bioinformatic identification and expression analysis of new microRNAs from Medicago truncatula[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會2008年學(xué)術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2008年

9 ;Cell-free miRNAs may indicate diagnosis and docetaxel sensitivity of tumor cells in malignant effusions[A];中華醫(yī)學(xué)會腫瘤學(xué)分會第七屆全國中青年腫瘤學(xué)術(shù)會議——中華醫(yī)學(xué)會腫瘤學(xué)分會“中華腫瘤 明日之星”大型評選活動暨中青年委員全國遴選論文匯編[C];2011年

10 ;miRNAs involved in Tau expression of BMSCs induced neurons[A];中國神經(jīng)科學(xué)學(xué)會第九屆全國學(xué)術(shù)會議暨第五次會員代表大會論文摘要集[C];2011年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 江尚;特異性miRNAs與前列腺癌發(fā)病密切相關(guān)[N];中國醫(yī)藥報;2007年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳健德;新生兒膿毒癥miRNAs表達譜及其免疫調(diào)節(jié)作用研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 A.B.M.Khaldun;[D];中國科學(xué)院研究生院(武漢植物園);2015年

3 成鷹;大腸桿菌和布魯氏菌脂多糖刺激條件下巨噬細胞差異表達miRNAs的鑒定及其作用機制[D];海南大學(xué);2014年

4 王奕;MiRNAs在白癜風(fēng)外周血單個核細胞中的表達及miR-3940-5p對T細胞作用機制的研究[D];山東大學(xué);2015年

5 陳科;小鼠子宮內(nèi)膜mRNAs和miRNAs時空表達與胚胎著床的關(guān)系及SPOP對基質(zhì)細胞蛻膜化的影響[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

6 陳芳;鵝肥肝生成相關(guān)miRNAs、基因的鑒定及功能研究和就巢性相關(guān)miRNAs的鑒定[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

7 顧麗紅;北京鴨胚胎期胸肌發(fā)育相關(guān)基因與miRNAs表達模式鑒定及其互作關(guān)系研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

8 于鵬;miRNAs對骨髓間充質(zhì)干細胞分化的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

9 吳紹華;不同倍性水稻miRNAs及其靶基因的鑒定與表達分析[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

10 陳毅鵬;酒精性肝病特異性miRNAs表達譜及下游調(diào)控基因研究[D];浙江大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 姜青華;丹參miRNAs組織特異表達譜及其靶基因鑒定[D];杭州師范大學(xué);2015年

2 劉元會;抑郁患者腦脊液和血清中差異性miRNAs鑒定的臨床研究[D];四川醫(yī)科大學(xué);2015年

3 賈文慧;宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌血清miRNAs的研究[D];南京大學(xué);2013年

4 許成辰;不同HER-2水平的人乳腺癌MCF-7細胞內(nèi)miRNAs表達譜及相關(guān)miRNAs對癌細胞生物學(xué)行為的影響[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

5 曹文婷;奶山羊乳腺組織miRNAs的鑒定、篩選及功能的初步研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

6 劉帥帥;循環(huán)miRNAs檢測對肝癌診斷價值的meta分析[D];蚌埠醫(yī)學(xué)院;2015年

7 王蕊;喉癌相關(guān)miRNAs的篩選及其功能的初步研究[D];南華大學(xué);2015年

8 雷彬;大白豬和二花臉豬排卵前卵泡差異表達miRNAs及其靶基因鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

9 葛瑩;綿羊不同發(fā)情狀態(tài)下松果體若干miRNAs表達差異及其與AANAT靶關(guān)系鑒定[D];揚州大學(xué);2015年

10 湯自征;RA-FLS的遷移、侵襲及RA相關(guān)miRNAs表達水平的檢測[D];揚州大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：豬細小病毒感染PK-15細胞前后microRNAs表達譜的研究及部分免疫功能的鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：334306