本文關(guān)鍵詞：兩品種鴨法氏囊差異表達(dá)基因、miRNA的富集及驗證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：遺傳效應(yīng)是決定動物機(jī)體抗病力強(qiáng)弱的主要因素之一。有資料表明,地方鴨品種往往比經(jīng)過系統(tǒng)選育的肉鴨品種表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗病力,二者在不同階段免疫器官的發(fā)育也存在差異,免疫相關(guān)指標(biāo)所反映出的抗逆能力也不盡相同。為研究地方鴨和培育鴨品種在抗病力上存在差異的原因,擬以建昌鴨(JCH)和農(nóng)華肉鴨(PK)為試驗對象,構(gòu)建建昌鴨和農(nóng)華肉鴨4周齡法氏囊混合組織樣(JCF、PKF)的數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE),并進(jìn)行小RNA測序,獲得兩品種鴨法氏囊組織中的差異表達(dá)基因及miRNA,采用qRT-PCR技術(shù)對篩選出的部分差異表達(dá)基因和miRNA進(jìn)行驗證,并將二者進(jìn)行聯(lián)合分析,試圖找到影響兩品種鴨抗病能力的關(guān)鍵基因及關(guān)鍵miRNA,為鴨的免疫調(diào)控機(jī)制及抗病育種研究提供參考。試驗結(jié)果表明：DGE結(jié)果中,JCF共獲得18870755個reads,經(jīng)過濾得到18438616個clean reads; PKF共獲得14281414個reads,經(jīng)過濾得到13983876個clean reads。相對于PKF, JCF有95個表達(dá)上調(diào)基因、100個表達(dá)下調(diào)基因。通過對差異表達(dá)基因的GO (Gene ontology)分析,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要被富集到蛋白代謝、高分子代謝及核糖體組分中；通過差異基因的KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析,發(fā)現(xiàn)在剪切體相關(guān)通路、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)過程、RNA降解過程、Jak-STAT信號通路、TNF信號通路及B細(xì)胞受體信號通路等均有差異基因富集。篩選出差異顯著的與免疫相關(guān)的10個差異表達(dá)基因并對其進(jìn)行qRT-PCR驗證。通過檢測這些基因在JCF中3、4、5周齡(W3、W4、W5)時對于PKF相對表達(dá)量的變化倍數(shù),發(fā)現(xiàn)W3時有7個基因相對表達(dá)量的變化趨勢與預(yù)測結(jié)果一致,W4和W5時僅有3個基因的驗證結(jié)果與預(yù)測結(jié)果一致。小RNA測序在JCF和PKF中分別獲得11496755和11962192個reads,經(jīng)過濾分別得到8234150和8105240個clean reads。相對于PKF, JCF中總共篩選出23個上調(diào)miRNAs、41個下調(diào)miRNAs。JCF中預(yù)測到的新miRNA有26種,PKF中有27種。通過對miRNA候選靶基因進(jìn)行GO分析,靶基因主要在細(xì)胞組分被富集,通過KEGG分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在代謝通路有最多的靶基因被富集,其他如癌癥信號通路、腸道生成IgA的免疫網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞因子間受體互作及甲型流感等通路中均有顯著的靶基因被注釋。對篩選出的差異最為顯著的10個miRNA進(jìn)行qRT-PCR驗證。通過檢測JCF中差異miRNA對于PKF相對表達(dá)量的變化倍數(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)W3、W4、W5時均有7個及以上的miRNA的變化趨勢與預(yù)測結(jié)果一致。通過對差異表達(dá)基因和差異miRNA進(jìn)行聯(lián)合分析,發(fā)現(xiàn)差異miRNA的表達(dá)發(fā)生變化時,對應(yīng)的靶基因的表達(dá)均發(fā)生顯著變化。GO分析結(jié)果顯示miRNA的靶基因主要富集到代謝過程,KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)niRNA的靶基因主要富集在核糖體信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白過程及RNA降解過程中。綜上所述,建昌鴨和農(nóng)華肉鴨的法氏囊組織中篩選到195個差異表達(dá)基因、64個差異niRNA,以及差異表達(dá)基因和miRNA靶基因在多個分子過程和免疫應(yīng)答相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如抗原加工與呈遞、細(xì)胞因子間受體互作及B細(xì)胞受體信號等通路是構(gòu)成兩品種鴨法氏囊功能差異的基礎(chǔ)。以上研究為進(jìn)一步揭示鴨的免疫調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：鴨 法氏囊 數(shù)字基因表達(dá)譜 小RNA測序
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S834
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 前言12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-26
• 1.1 法氏囊12-18
• 1.1.1 組織結(jié)構(gòu)13
• 1.1.2 發(fā)育特點13-15
• 1.1.3 法氏囊的免疫功能15-18
• 1.2 與法氏囊免疫功能相關(guān)的重要基因及miRNA18-22
• 1.2.1 影響法氏囊發(fā)育、功能的主要基因18-20
• 1.2.2 參與免疫調(diào)控的miRNA20-22
• 1.3 高通量技術(shù)在禽類免疫基因富集中的應(yīng)用22-24
• 1.4 遺傳背景不同與免疫功能差異24-25
• 1.5 研究目的和意義25-26
• 2 材料與方法26-35
• 2.1 試驗材料26-27
• 2.1.1 試驗動物26
• 2.1.2 試劑與設(shè)備26-27
• 2.2 試驗方法27-35
• 2.2.1 樣品的制備27-28
• 2.2.2 數(shù)字基因表達(dá)譜的構(gòu)建28-30
• 2.2.3 DEG差異表達(dá)基因的驗證30-31
• 2.2.4 Small RNA測序31-33
• 2.2.5 差異miRNA的驗證33-34
• 2.2.6 差異miRNA與差異DGE的聯(lián)合分析34-35
• 2.3 數(shù)據(jù)處理35
• 3 結(jié)果與分析35-57
• 3.1 RNA提取效果35-36
• 3.2 差異表達(dá)基因富集及驗證36-44
• 3.2.1 測序質(zhì)量及序列比對統(tǒng)計結(jié)果36
• 3.2.2 Reads與參考基因組比對情況統(tǒng)計36-37
• 3.2.3 RNA-seq整體質(zhì)量評估37-39
• 3.2.4 差異表達(dá)基因的篩選39-40
• 3.2.5 差異基因GO分析40-41
• 3.2.6 差異基因KEGG分析41-42
• 3.2.7 差異表達(dá)基因驗證42-44
• 3.3 差異表達(dá)miRNA富集及驗證44-54
• 3.3.1 測序質(zhì)量的評估及小RNA長度分布44
• 3.3.2 miRNA公共及特有序列分析44-45
• 3.3.3 堿基偏好性分布45-46
• 3.3.4 小RNA分類注釋統(tǒng)計46-47
• 3.3.5 樣品間相關(guān)性檢查47-48
• 3.3.6 miRNA差異表達(dá)分析結(jié)果48-50
• 3.3.7 差異miRNA靶基因功能富集分析50-52
• 3.3.8 差異表達(dá)miRNA驗證52-54
• 3.4 差異miRNA與差異DGE的聯(lián)合分析54-57
• 3.4.1 miRNA-mRNA的關(guān)聯(lián)分析54-55
• 3.4.2 miRNA靶基因與差異表達(dá)基因的聯(lián)合GO分析55-56
• 3.4.3 miRNA靶基因與差異表達(dá)基因的聯(lián)合KEGG富集分析56-57
• 4 討論57-64
• 4.1 兩品種鴨法氏囊功能差異的基因和miRNA57-59
• 4.2 兩品種鴨法氏囊功能差異的分子過程59-60
• 4.3 基于差異表達(dá)基因和差異miRNA的主要信號通路60-62
• 4.4 本研究的不足和后續(xù)改進(jìn)62-64
• 5 結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-74
• 致謝74-75
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文75

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