華支睪吸蟲(chóng)（Clonorchis sinensis）病又稱(chēng)肝吸蟲(chóng)病,全球約3500萬(wàn)人感染,其中中國(guó)有超過(guò)1200萬(wàn)人感染。人或其他哺乳動(dòng)物由于食用生或半生被囊蚴感染的魚(yú)蝦而感染此病。華支睪吸蟲(chóng)囊蚴經(jīng)過(guò)一個(gè)月便可以在宿主體內(nèi)發(fā)育為成蟲(chóng),成蟲(chóng)寄生于人體膽管及膽囊中,可引起肝臟受損,進(jìn)而導(dǎo)致肝膽疾病及混合細(xì)菌感染等。兒童和青少年感染華支睪吸蟲(chóng)后,臨床表現(xiàn)較重,除肝膽癥狀外,常伴有營(yíng)養(yǎng)不良、貧血、低蛋白血癥、浮腫和發(fā)育障礙,是一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)病。現(xiàn)階段對(duì)于華支睪吸蟲(chóng)的檢測(cè),目前所使用的加藤厚涂片法存在漏檢,誤檢等缺陷。實(shí)驗(yàn)室常用的分子生物學(xué)檢測(cè)的方法有傳統(tǒng)PCR、巢式PCR、熒光定量PCR等,免疫學(xué)檢測(cè)方法普遍為ELISA。但這些傳統(tǒng)的分子生物學(xué)及免疫學(xué)檢測(cè)方法成本較高、操作繁瑣、耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng),進(jìn)而無(wú)法滿(mǎn)足基層實(shí)地快速化檢測(cè)。因此,開(kāi)發(fā)低成本、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短的華支睪吸蟲(chóng)檢測(cè)方法,可以大大提高華支睪吸蟲(chóng)檢測(cè)效率,并為華支睪吸蟲(chóng)的防控提供新的方法和技術(shù)支持。本研究針對(duì)華支睪吸蟲(chóng)ITS-2基因序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物,并對(duì)該體系的靈敏度、特異性等進(jìn)行驗(yàn)證后初步建立了華支睪吸蟲(chóng)環(huán)... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

華支睪吸蟲(chóng)的生活史Fig.1.1LifehistoryofClonorchissinensis

第一篇文獻(xiàn)綜述第三章LAMP及RPA檢測(cè)方法的概述與應(yīng)用15序列從而進(jìn)行擴(kuò)增[78]，原理如圖1.2。圖1.2LAMP擴(kuò)增反應(yīng)原理Fig.1.2LAMPamplificationreactionprinciple3.2RPA檢測(cè)方法及原理RPA又稱(chēng)重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RecombinasePolymeraseAmplification，RPA），是2006年英國(guó)TwistDx公司開(kāi)發(fā)出的一種新型等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，RPA檢測(cè)的靈敏度很高，能夠?qū)⒑哿康暮怂幔ㄓ绕涫荄NA）模板擴(kuò)增到可以檢出的水平，從單個(gè)模板分子得到大約1012擴(kuò)增產(chǎn)物[79]。并且RPA不需要復(fù)雜的樣品處理，更適用于無(wú)法提取核酸的實(shí)地檢測(cè)，該方法將徹底改變?cè)谫Y源有限的環(huán)境下擴(kuò)增和檢測(cè)核酸的能力，在病原快速化檢測(cè)方面，具有廣闊的應(yīng)用前景[80]。RPA主要依賴(lài)于與單鏈核酸（即寡核苷酸引物）結(jié)合的三種酶，這三種酶分別是單鏈DNA結(jié)合蛋白（Single-strandedDNA-bindingprotein，SSB）和鏈置換DNA聚合酶及重組酶，三種酶多以?xún)龈煞坌问奖４鎇81]。重組酶可以結(jié)合引物，形成酶聯(lián)引物復(fù)合物，該復(fù)合物與相應(yīng)的DNA鏈快速互補(bǔ)配對(duì)。發(fā)生鏈替換后，復(fù)合物進(jìn)入5’端形成D環(huán)結(jié)構(gòu)；此時(shí)，SSB與其結(jié)合，然后DNA聚合酶識(shí)別重組酶后并將其降解。暴露引物的3’端后，聚合酶借此機(jī)會(huì)結(jié)合到復(fù)合物的3’端以進(jìn)

第一篇文獻(xiàn)綜述第三章LAMP及RPA檢測(cè)方法的概述與應(yīng)用16行鏈延伸并形成新的雙鏈DNA。整個(gè)過(guò)程不涉及復(fù)雜的溫度變化過(guò)程，整個(gè)過(guò)程的溫度恒定在37—42℃之間，在15-30min內(nèi)完成DNA模板的擴(kuò)增。RPA可以擴(kuò)增DNA片段，同時(shí)也可以擴(kuò)增RNA片段[82]。AhmedAbdEIWahed建立了逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RT-RPA）用于檢測(cè)冠狀病毒，該技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有同樣的靈敏度及特異性[83]。RPA設(shè)計(jì)引物與普通PCR類(lèi)似，但是也有區(qū)別，雖然設(shè)計(jì)方法類(lèi)似，但是普通PCR引物卻不適于RPA擴(kuò)增，RPA引物設(shè)計(jì)要注意引物和擴(kuò)增子的長(zhǎng)度、引物序列及引物對(duì)同源序列的選擇性。普通PCR引物長(zhǎng)度大約為25bp不等，RPA引物長(zhǎng)度大于30bp，一般為30-35bp，因?yàn)檫@是重組酶介導(dǎo)引物與同源雙鏈匹配的最小長(zhǎng)度，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度設(shè)計(jì)在100-300bp為最佳。但最近的RPA試劑盒支持?jǐn)U增長(zhǎng)度大于500bp，但是這會(huì)導(dǎo)致靈敏度和反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)[84]。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)避免5’端過(guò)多的鳥(niǎo)嘌呤，在3’端設(shè)計(jì)一個(gè)GC夾，GC含量應(yīng)該控制在30-70%，這可以避免引物自身的發(fā)夾結(jié)構(gòu)及引物之間形成二聚體，由于各種因素的限制，僅憑理論無(wú)法設(shè)計(jì)出最佳引物，所以我們需要設(shè)計(jì)多組引物進(jìn)行篩選[85]。RPA反應(yīng)原理如圖1.3。圖1.3RPA擴(kuò)增反應(yīng)原理Fig.1.3RPAamplificationreactionprinciple

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碩士論文
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本文編號(hào)：3275323