發(fā)布時(shí)間：2021-07-09 19:08

　　大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）作為我國(guó)重要的海洋經(jīng)濟(jì)物種之一,由于常年過(guò)度的捕撈,天然資源遭受?chē)?yán)重破壞,其漁業(yè)資源亟待補(bǔ)充。因此,研究大黃魚(yú)生長(zhǎng)相關(guān)的調(diào)控機(jī)制具有重要的實(shí)際意義。本論文主要基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)開(kāi)發(fā)了大黃魚(yú)神經(jīng)肽Y（Neuropeptide Y;NPY）高活性表達(dá)技術(shù),并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的活性進(jìn)行了評(píng)測(cè);同時(shí)以實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建的FLAG-LcNPY2R/7R（FLAG-Larimichthys crocea Neuropeptide Y2/Y7 Receptor）,LcNPY2R/7R-EGFP（Larimichthys crocea Neuropeptide Y2/Y7 Receptor-EGFP）融合表達(dá)載體為基礎(chǔ),對(duì)合成和分泌制備的多肽LcNPY激活LcNPY2R/7R后介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究。通過(guò)在pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體中插入LcNPY成熟肽、LcNPY 18-36截?cái)囿w多肽、六聚組氨酸連接成熟肽和六聚組氨酸連接18-36截?cái)囿w多肽這四種重組插入片段,成功構(gòu)建出能夠表達(dá)大黃魚(yú)NPY的真核表達(dá)系統(tǒng)。將固相合成的LcNPY作為對(duì)照,... 

【文章來(lái)源】：浙江海洋大學(xué)浙江省

【文章頁(yè)數(shù)】：69 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

NPY在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用[25]

大黃魚(yú)神經(jīng)肽Y的高活性表達(dá)及活性功能特征研究6圖1.2內(nèi)源性和外源性（靜脈）PVAX/NPY3-36相關(guān)血管生成機(jī)制[68]。Fig1.2Summaryofproposedmechanismforendogenousandexogenous(intravenous)PVAX/NPY3-36-associatedangiogenesis.1.3.3NPY對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)NPY分布于下丘腦弓狀核、室旁核、室周核、正中隆起等多個(gè)區(qū)域，這些區(qū)域又是許多內(nèi)分泌細(xì)胞存在的部位，它們相互聯(lián)系共同調(diào)節(jié)機(jī)體復(fù)雜的生理活動(dòng)。已有的研究證明，NPY對(duì)生長(zhǎng)激素（GH）、促性腺激素釋放激素（gonadotropinreleasinghormone，GnRH）、催乳素（prolactin，PRL）、促甲狀腺激素（thyroidstimulatinghormone，TSH）、生長(zhǎng)抑素（Somatostatin，SS）、黃體生成素（luteinizinghormone，LH）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropinreleasinghormone，CRH）和促性腺激素（GtH）等內(nèi)分泌激素都有一定的調(diào)節(jié)作用[48,69,70]。1.3.3.1NPY對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamic–pituitary–gonadalaxis，HPG軸）調(diào)節(jié)的影響研究表明下丘腦-垂體-性腺軸釋放的激素分別為：GnRH、LH/卵泡刺激素（follicle-stimulatinghormone，F(xiàn)SH）和性激素。GnRH/GnRHR信號(hào)系統(tǒng)是生殖發(fā)育HPG調(diào)控軸的關(guān)鍵組成。早在1988年，在研究NPY、GnRH在兔子以及小鼠中表

152.1.2.4LcNPY氨基酸同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析使用Bioedit程序?qū)Χ辔锓NNPY成熟肽氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)和同源性分析；利用MEGA5.2軟件，通過(guò)鄰接法(NJ法)構(gòu)建NPY基因分子進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)(Bootstrap重復(fù)1000次計(jì)算各分支置信度)。2.2結(jié)果2.2.1LcNPY的哺乳動(dòng)物真核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建基于已有數(shù)據(jù)庫(kù)得到優(yōu)化后的密碼子（表2.3）。采用限制性核酸內(nèi)切酶HindIII和BamHI對(duì)pcDNA3.1-NPY質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定（圖2.1）。根據(jù)目的條帶的位置，初步斷定正確性，繼而通過(guò)測(cè)序結(jié)果確認(rèn)序列與LcNPY的序列完全一致，證明pcDNA3.1-NPY融合蛋白表達(dá)載體構(gòu)建成功。使用snapgene軟件繪制pcDNA3.1-NPY1-36真核表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖（圖2.2）。圖2.1pcDNA3.1-NPY質(zhì)粒雙酶切鑒定圖Fig2.1ElectrophoretogramofdigestionbyrestrictionenzymesHindIIIandBamHI圖2.2pcDNA3.1-NPY1-36真核表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖Fig2.2ThestructureofeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1-NPY1-36大黃魚(yú)神經(jīng)肽Y的高活性表達(dá)及活性功能特征研究


本文編號(hào)：3274323