本文關(guān)鍵詞：海南辣椒病毒病病原種類(lèi)及株系多樣性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：辣椒是海南省冬季瓜菜生產(chǎn)主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一,是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入的主要來(lái)源。但是近年來(lái),辣椒病毒病卻在熱帶亞熱帶地區(qū)盛行,對(duì)辣椒造成嚴(yán)重質(zhì)量下降和巨大產(chǎn)量損失。尤其是馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)病毒,該屬病毒是辣椒上常見(jiàn)的病毒種類(lèi),對(duì)辣椒危害大,且自身變異率高,株系分化嚴(yán)重,常伴有混合侵染,嚴(yán)重危害海南辣椒產(chǎn)業(yè)。為明確海南辣椒病毒病的病原種類(lèi)及其優(yōu)勢(shì)株系,本研究開(kāi)展了辣椒病毒病調(diào)查研究和病毒種類(lèi)、株系多樣性檢測(cè)分析。 首先,為全面了解侵染海南辣椒的病毒種類(lèi),我們于2013-2014年環(huán)海南島采集辣椒病毒病疑似樣品共141份,并通過(guò)RT-PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,共檢測(cè)到辣椒帶毒樣品99份,病毒檢出率為70.2%。共檢測(cè)出5種辣椒病毒,分別為辣椒環(huán)斑病毒(Chilli ringspot virus, ChiRSV)、甜椒脈斑駁病毒(Pepper veinal mottle virus, PVMV)、辣椒脈斑駁病毒(Chilli veinal mottle virus, ChiVMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)、辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)。其中,PVMV是運(yùn)用Potyvirus屬病毒的簡(jiǎn)并引物首次在海南辣椒上檢測(cè)到的一種病毒。 其次,為深入了解辣椒病毒病的種類(lèi)及其危害情況,我們對(duì)海南辣椒病毒檢出情況進(jìn)行了分析。以上5種病毒的檢出率分別為ChiRSV38.4%、PVMV36.4%、ChiVMV14.1%、CMV40.4%口PMMoV37.4%。可見(jiàn)CMV的檢出率最高,說(shuō)明CMV仍然是海南辣椒上的優(yōu)勢(shì)病毒,但ChiRSV、PVMV、ChiVMV這3種Potyvirus屬病毒已經(jīng)發(fā)展成為海南辣椒上不可忽視的毒原,尤其是PVMV的危害不可忽視。辣椒上病毒間復(fù)合侵染嚴(yán)重,約一半的樣品被至少2種或2種以上的病毒共同侵染,最常見(jiàn)的復(fù)合侵染類(lèi)型以ChiRSV+PVMV和CMV+ChiRSV+PVMV形式為主。 第三,為澄清侵染辣椒的病毒的株系和親緣關(guān)系,我們克隆了ChiRSV、PVMV和ChiVMV3種potyviruses的cp基因,進(jìn)行了序列多態(tài)性分析。運(yùn)用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明：ChiVMV各分離物能分成4組,分別命名為Group1、 Group2、Group3和Group4, ChiVMV海南分離物之間的cp基因序列一致性大于98%,是一個(gè)株系,且屬于其中的ChiVMV Group1株系；根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),ChiRSV海南分離物的cp基因分成兩個(gè)有差異的簇,各簇內(nèi)的ChiRSV cp基因序列一致性高,但簇與簇的分離物之間的cp基因序列與CP氨基酸序列一致性分別為91.6%—100%,92.9%—100%,因此海南辣椒上存在兩個(gè)ChiRSV株系,暫命為ChiRSV I組與ChiRSVⅡ組；PVMV海南分離物cp基因序列一致性大于98%,聚為一簇,屬于一個(gè)PVMV株系,暫命為PVMV亞洲組。 第四,為明晰侵染辣椒的potyviruses的VPg基因分化,我們克隆了ChiRSV、 PVMV和ChiVMV3種potyviruses的VPg基因,進(jìn)行了序列多態(tài)性分析。運(yùn)用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明：ChiVMV海南分離物的VPg基因序列一致性高于98%,PVMV海南分離物VPg基因序列一致性為97.9%—100%,而ChiRSV有兩個(gè)組,a組與b組分離物之間的VPg基因序列與VPg氨基酸序列一致性分別為86.6%—100%,92.6%—100%。因此,海南辣椒上的ChiVMV和PVMV分離物僅各存在1組序列高度保守的VPg基因序列；ChiRSV海南分離物的VPg基因序列分成有差異的兩個(gè)組。 本研究通過(guò)開(kāi)展海南辣椒病毒病病原種類(lèi)的鑒定,分子變異及群體結(jié)構(gòu)特征等多態(tài)性分析,有利于了解辣椒病毒的發(fā)生、流行和防控,為開(kāi)展抗病毒分子育種提供了科學(xué)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：辣椒病毒病 馬鈴薯Y病毒屬 cp基因 VPg基因 序列分析 系統(tǒng)進(jìn)化
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S436.418.12
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 前言11-24
• 1.1 辣椒病毒病研究進(jìn)展11-18
• 1.1.1 辣椒產(chǎn)業(yè)概況11
• 1.1.2 侵染辣椒的主要病毒及其分布11-12
• 1.1.3 我國(guó)辣椒病毒病病原種類(lèi)12-13
• 1.1.4 辣椒病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象13-14
• 1.1.5 辣椒病毒的傳播14
• 1.1.6 辣椒病毒病的防治方法14-15
• 1.1.7 CMV的防治研究15
• 1.1.8 potyviruses的防治研究15-17
• 1.1.9 tobamoviruses的防治研究17-18
• 1.2 Potyvirus研究進(jìn)展18-22
• 1.2.1 Potyvirus常見(jiàn)病毒及其危害18
• 1.2.2 Potyvirus生物學(xué)特征18-19
• 1.2.3 Potyvirus基因組結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白19-20
• 1.2.4 Potyvirus定種標(biāo)準(zhǔn)20
• 1.2.5 Potyvirus遺傳多樣性20-21
• 1.2.6 Potyvirus屬病毒VPg基因研究21-22
• 1.3 本研究的目的及意義22-23
• 1.4 技術(shù)路線23-24
• 2 材料與方法24-31
• 2.1 材料24-25
• 2.1.1 樣品材料24
• 2.1.2 主要儀器24-25
• 2.1.3 主要試劑25
• 2.1.4 生物信息學(xué)工具25
• 2.2 方法25-31
• 2.2.1 疑似病毒感染的141個(gè)辣椒樣品葉片總RNA的提取25-26
• 2.2.2 疑似病毒感染的辣椒樣品葉片總RNA的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)26
• 2.2.3 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可靠性檢驗(yàn)26-27
• 2.2.4 PCR檢測(cè)病原27
• 2.2.5 PCR病原檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次27
• 2.2.6 序列分析鑒定病原27
• 2.2.7 cp和VPg基因克隆用引物信息27
• 2.2.8 cp和VPg基因目的片段的擴(kuò)增27-29
• 2.2.9 cp和VPg基因目的片段的回收純化29-30
• 2.2.10 連接30
• 2.2.11 轉(zhuǎn)化30
• 2.2.12 抗生素篩選陽(yáng)性克隆30
• 2.2.13 菌液PCR鑒定重組子30
• 2.2.14 測(cè)序分析30-31
• 3 結(jié)果與分析31-59
• 3.1 海南辣椒病毒病病原鑒定結(jié)果31-38
• 3.1.1 樣品RNA提取結(jié)果31
• 3.1.2 反轉(zhuǎn)錄結(jié)果31
• 3.1.3 海南辣椒病毒病病原種類(lèi)鑒定結(jié)果31-32
• 3.1.4 海南辣椒上5種病毒病主要癥狀32-34
• 3.1.5 病毒間的復(fù)合感染34-36
• 3.1.6 病毒復(fù)合侵染寄主植物癥狀36-38
• 3.2 potyviruses cp基因的克隆與分析38-49
• 3.2.1 ChiVMV cp基因的克隆和序列分析38
• 3.2.2 ChiVMV cp基因多態(tài)性38-39
• 3.2.3 ChiVMV cp基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)39-41
• 3.2.4 基于cp基因的ChiVMV株系劃分41-42
• 3.2.5 ChiRSV cp基因的克隆和序列分析42
• 3.2.6 ChiRSV cp基因多態(tài)性42-45
• 3.2.7 ChiRSV cp基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)45
• 3.2.8 基于cp基因的ChiRSV株系劃分45-46
• 3.2.9 PVMV cp基因的克隆和序列分析46-47
• 3.2.10 PVMV cp基因的多態(tài)性47-48
• 3.2.11 PVMV cp基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)48-49
• 3.3 potyviruses VPg基因的克隆與分析49-59
• 3.3.1 ChiVMV VPg基因的克隆與分析49-50
• 3.3.2 ChiVMV VPg基因多態(tài)性50-51
• 3.3.3 ChiVMV VPg基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)51-52
• 3.3.4 ChiRSV VPg基因的克隆和序列分析52
• 3.3.5 ChiRSV VPg基因多態(tài)性52-53
• 3.3.6 ChiRSV VPg基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)53-55
• 3.3.7 PVMV VPg基因的克隆和序列分析55-56
• 3.3.8 PVMV VPg基因多態(tài)性56-58
• 3.3.9 PVMV VPg基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)58-59
• 4 討論59-62
• 4.1 辣椒病毒多樣性59-60
• 4.2 病毒的復(fù)合侵染60
• 4.3 病毒基因多態(tài)性分析60-61
• 4.4 病毒株系的劃分標(biāo)準(zhǔn)61-62
• 5 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 縮略語(yǔ)表70-72
• 附錄72-73
• 致謝73

【相似文獻(xiàn)】

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