對(duì)蝦養(yǎng)殖是重要的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè),但長(zhǎng)期遭受病害侵襲。研究對(duì)蝦與病原的互作機(jī)制,對(duì)開發(fā)綠色可持續(xù)的病害防控策略有重要意義。腸道菌群存在于所有后生動(dòng)物的腸道中,與宿主的免疫、消化和代謝等生理過程密切相關(guān)。維持宿主腸道菌群的穩(wěn)態(tài)對(duì)于其健康狀態(tài)以及疾病的預(yù)防具有十分重要的作用。然而,對(duì)蝦如何維持自身腸道菌群穩(wěn)態(tài)的機(jī)制卻鮮有報(bào)道。我們?cè)谌毡灸覍?duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）中鑒定到一種特異表達(dá)于消化道且明顯響應(yīng)經(jīng)口細(xì)菌感染的C型凝集素（C-typelectin,CTL）CTL33,并研究了其在腸道菌群穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的功能和作用機(jī)制。采用RNAi方法抑制CTL33表達(dá)導(dǎo)致腸道細(xì)菌大量增殖、致病菌比例升高、腸道組織受損和對(duì)蝦死亡等后果。機(jī)制研究表明CTL33可介導(dǎo)腸道共生細(xì)菌形成生物被膜結(jié)構(gòu)在腸道內(nèi)定植和穩(wěn)定存在。CTL33通過識(shí)別細(xì)菌表面多糖結(jié)合細(xì)菌,其N端區(qū)域二聚化,使得CTL33-細(xì)菌復(fù)合物彼此交織形成生物被膜狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)一方面限制了菌群與腸道上皮的接觸,另一方面增強(qiáng)了菌群對(duì)腸道免疫壓力的耐受能力。因此,本研究發(fā)現(xiàn)了一種CTL介導(dǎo)的新的腸道菌群穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制,也為基于腸道菌群穩(wěn)態(tài)維持... 

【文章來源】：山東大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：67 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２．ＣＴＬ３３的表達(dá)模式

ｔｅｒ?ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔｔｉｎｇ?ｗａｓ?ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ?ａｔ?６?ｄ??ａｆｔｅｒ?ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．?Ｄａｔａ?ｗｅｒｅ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ?ｏｆ?ｔｗｏ?ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，?ａｎｄ?ｅａｃｈ??ｓａｍｐｌｅ?ｗａｓ?ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?６?ａｎｉｍａｌｓ．??為了揭示ＣＴＬ３３在對(duì)蝦腸道中的特異功能，我們采用ＲＮＡｉ方法抑制ＣＴＬ３３??的表達(dá)。如圖３Ａ所示，通過注射可顯著抑制ＣＴＬ３３的表達(dá)。出乎意??料的是，即便沒有進(jìn)行額外的感染，ＣＴＬ３３的基因沉默直接導(dǎo)致了對(duì)蝦死亡。對(duì)??蝦死亡從ＲＮＡｉ后的第一天即開始出現(xiàn)，并抑制持續(xù)。在注射ＣＴＬ３３ｄｓＲＮＡ６ｄ??后，超過一半的對(duì)蝦死亡，而對(duì)照組（注射ＧＦＰｄｓＲＮＡ）則沒有死亡（圖３Ｂ）。??為了發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦死亡的原因，我們將瀕死的日本囊對(duì)蝦的腸組織進(jìn)行組織切片和染??色以檢查是否有組織形態(tài)學(xué)改變。如圖３Ｃ所示，ＣＴＬ３３基因沉默導(dǎo)致了對(duì)蝦腸??道的明顯損傷。在抑制ＣＴＬ３３表達(dá)后，附著在腸上皮上的粘膜變薄，甚至從上??皮上脫落。上皮細(xì)胞密度降低，腸壁變保這些癥狀顯示ＣＴＬ３３表達(dá)的沉默破??壞了對(duì)蝦腸道內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。??Ａ?１．５－，?６?１００?？］￣！???｜?丁?￣?８０＇?］?ｐ?＜?〇．〇〇１??｜１〇－?ｐＨ?Ｉ?６０－?匕一！一??？?〇?４０－?…??Ｉ?〇．５－?０??ｄｓＧＦＰ，?ｎ＝４０??１?＾?２０－??２?＊＊＊?ｄｓＣＴＬ３３，?ｎ＝４０??０．０?ＩＩ?ｌ?Ｌ－ｒ－Ｌ?〇

?，／?。?Ｓ?Ｓ?ｇ??°＇２＇?ｒＣＴＬ３３－｜?ｈ：?ｕｍｍｍｇｍ??－￣２５?ＩｒＵ一＾?ｒＴａＳ－３＿?ｍＢｍＶ－ｔＵｂｉａＳｈ＂??０．００１?０．０１?０．１?１?°?Ｓ?ｇ?ｓ?Ｓ??ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?（ｐＭ）?ＯＤ５７０??Ｄ?Ｅ?？??〇６?一口「Ｔａｇ?ＨｒＣＴＬ３３?？??工?Ａ?些?小??ｇ?°－４－?，?＼?＾?ｉ?ｉ?ｔ?〇〇ｉ＊?ｔ??§，偏』』Ｊ?Ｊ?§．ｒｍＨ?ｎｉｌ??二擎☆＜，：＋：?＋：??圖５．ＣＴＬ３３介導(dǎo)對(duì)蝦腸道菌群形成生物被膜。（Ａ）?ＣＴＬ３３的重組表達(dá)及純化。重組表達(dá)釆??用ｐＥＴ３２ａ?（＋）表達(dá)載體和Ｒｏｓｓｅｔａ?（ＤＥ３）細(xì)胞，并以親和層析法進(jìn)行純化。ＣＢ）?ｒＣＴＬ３３??與ＬＰＳ的結(jié)合。以ＬＰＳ?（４問）包被９６孔板并風(fēng)干。加入蛋白質(zhì)，２５?°Ｃ孵育３?ｈ。使用酶??聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)結(jié)合作用。結(jié)果顯示為三個(gè)獨(dú)立重復(fù)的平均值±５０。（Ｃ）?ｒＣＴＬ３３促??進(jìn)共生弧菌生物被膜的形成。將細(xì)菌接種在無菌的９６孔聚苯乙烯微孔板中，密度為１０６??ＣＦＵ／ｍｌ，采用ＬＢ培養(yǎng)基（３％ＮａＣｌ），加入ｒＣＴＬ３３或標(biāo)簽蛋白至終濃度為２．５＿〇?３０°Ｃ??下培養(yǎng)２４４８ｈ以形成生物被膜。結(jié)晶紫染色，在５７０ｎｍ處檢測(cè)吸光度。（：Ｄ）ｒＣＴＬ３３對(duì)其??它腸道共生菌生物被膜形成能力的影響。（Ｅ）?ＬＰＳ對(duì)ｒＣＴＬ３３促進(jìn)生物被膜形成能力的影??響。ＬＰＳ加入蛋白和細(xì)菌培養(yǎng)物，每孔５陽。對(duì)于所有生物被膜形成實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)顯示為三次??獨(dú)立試驗(yàn)得出的平均值±５０。圖像為三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的代表結(jié)果。??Ｆｉｇ．?５?Ｍｅｄｉａｔｉ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]南美白對(duì)蝦腸道微生物群落的分子分析[J]. 李可,鄭天凌,田蘊(yùn),袁建軍.  微生物學(xué)報(bào). 2007(04)



本文編號(hào)：3221036