本文關(guān)鍵詞：鰻弧菌MHK3株T6SS的功能性表達(dá)及抗菌特性，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是重要的海水養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌,廣泛生存于各種不同的海洋環(huán)境中。海洋細(xì)菌具有多種適應(yīng)海洋環(huán)境的策略,而鰻弧菌適應(yīng)海洋生態(tài)環(huán)境的機(jī)制研究不多。細(xì)菌的Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)是一種新的蛋白分泌系統(tǒng),在許多海洋細(xì)菌的致病性和環(huán)境適應(yīng)性方面發(fā)揮重要作用。本文開展了鰻弧菌MHK3株T6SS的表達(dá)及其介導(dǎo)的抑菌作用的研究,旨在深入了解鰻弧菌的生態(tài)適應(yīng)機(jī)制。主要的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：1.不同培養(yǎng)條件對(duì)鰻弧菌MHK3 T6SS表達(dá)和分泌功能的影響。Hcp(溶血素共調(diào)蛋白)是依賴T6SS分泌的一個(gè)基質(zhì)蛋白,有T6SS的細(xì)菌能夠?qū)cp分泌到細(xì)菌外是T6SS具有功能的一個(gè)重要特征。在實(shí)驗(yàn)室適宜培養(yǎng)條件下,鰻弧菌MHK3的T6SS具有分泌Hcp的功能。本研究利用qRT-PCR和Western bolt方法,分析MHK3在各種溫度(10℃、16℃、28℃、37℃)、鹽度(0.2%、0.5%、1.0%、3.0%、5.0%NaCl)和pH(6、7、8、9、10)條件下表達(dá)和分泌Hcp的特征。結(jié)果顯示,Hcp在10-37℃培養(yǎng)時(shí)均可表達(dá)和分泌,在轉(zhuǎn)錄水平上,Hcp mRNA表達(dá)量隨溫度升高而降低,在10℃的表達(dá)量最高：在蛋白水平上,胞內(nèi)Hcp蛋白量在10-37℃變化不大,而胞外Hcp蛋白量在10-28℃較高,在37℃較低。Hcp在0.2-5%NaCl均有表達(dá)和分泌,在轉(zhuǎn)錄水平上,Hcp mRNA表達(dá)量在3% NaCl條件下最高,在其它鹽度條件下的表達(dá)量均較低；在蛋白水平上,胞內(nèi)和胞外Hcp蛋白量在0.5-5%NaCl均較高,在0.2%NaCl條件下較低。Hcp在pH 6-10均有表達(dá),在轉(zhuǎn)錄水平上,Hcp mRNA表達(dá)量在pH8時(shí)最高；在蛋白水平上,胞內(nèi)和胞外的Hcp蛋白量隨pH提高而減少,在pH 10時(shí)MHK3不分泌Hcp。蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,分泌到胞外的Hcp蛋白8h內(nèi)保持穩(wěn)定而不降解。上述結(jié)果表明,在海洋環(huán)境的物理因子變化較劇烈的條件下,鰻弧菌依然能夠表達(dá)和分泌Hcp,發(fā)揮T6SS的分泌功能。2.密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)基因luxO對(duì)MHK3 T6SS表達(dá)和分泌的影響。構(gòu)建了MHK3 luxO基因的缺失突變株(ΔluxO),研究發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下ΔluxO的生長(zhǎng)速率變慢。通過qRT-PCR和Western blot比較分析MHK3野生株及突變株ΔluxO、AvasC (MHK3 T6SS結(jié)構(gòu)基因vasC的缺失株)在不同生長(zhǎng)時(shí)期(OD540nm=0.1、0.6、1.0、2.0)Hcp的表達(dá)和分泌。結(jié)果顯示,與野生株MHK3相比,在整個(gè)生長(zhǎng)期ΔluxO和ΔvasC的Hcp mRNA轉(zhuǎn)錄水平很低,AluxO的胞內(nèi)和胞外沒有檢測(cè)到Hcp蛋白,而僅在AvasC胞內(nèi)能檢測(cè)到Hcp蛋白。這些結(jié)果說明,luxO基因在轉(zhuǎn)錄水平上影響hcp基因的表達(dá)；vasC基因的缺失導(dǎo)致T6SS結(jié)構(gòu)不完整,影響Hcp分泌到細(xì)胞外。3.鰻弧菌MHK3 T6SS介導(dǎo)的抑菌作用。分別建立野生株MHK3 (T6SS具有分泌Hcp的功能,Hcp+)及其突變株ΔluxO(T6SS沒有分泌Hcp的功能,Hcp-)、AvasC (Hcp)與大腸桿菌(Escherichia coli)和遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)的共培養(yǎng)體系,相互作用4h后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示,在MHK3 (Hcp+)與E. coli (Hcp-)或E. tarda (Hcp-)的共培養(yǎng)體系,MHK3 (Hcp+)的數(shù)量沒有明顯變化,而E.coli (Hcp-)或E. tarda (Hcp-)的細(xì)菌數(shù)量下降2-3 logs；在ΔluxO(Hcp-)或AvasC (Hcp-)與E. coli (Hcp-)或E. tarda (Hcp-)的共培養(yǎng)體系,所有的細(xì)菌數(shù)量沒有明顯變化。上述結(jié)果表明,T6SS介導(dǎo)鰻弧菌MHK3抑制E. coli和E.tarda的生長(zhǎng)。
【關(guān)鍵詞】：鰻弧菌 T6SS Hcp luxO 抑菌
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S941.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-24
• 1.1 弧菌概述13
• 1.2 鰻弧菌概述13-17
• 1.2.1 分類學(xué)地位及生物學(xué)特征13-14
• 1.2.2 鰻弧菌病14
• 1.2.3 鰻弧菌致病因子14-16
• 1.2.3.1 鐵螫合系統(tǒng)14-15
• 1.2.3.2 胞外產(chǎn)物15
• 1.2.3.3 趨化作用和運(yùn)動(dòng)性15
• 1.2.3.4 LPS15
• 1.2.3.5 胞外多糖15-16
• 1.2.3.6 外膜蛋白16
• 1.2.3.7 密度感應(yīng)系統(tǒng)16
• 1.2.4 鰻弧菌病的防治16-17
• 1.3 T6SS系統(tǒng)17-21
• 1.3.1 T6SS的結(jié)構(gòu)17-19
• 1.3.1.1 Hcp17
• 1.3.1.2 VgrG17-18
• 1.3.1.3 TssB/TssC(VipA/VipB)18
• 1.3.1.4 TssE18
• 1.3.1.5 TagL/TssL、TssJ、TssM18-19
• 1.3.2 T6SS的功能19-20
• 1.3.2.1 增強(qiáng)對(duì)宿主的致病性19
• 1.3.2.2 減少宿主的致病性19-20
• 1.3.2.3 介導(dǎo)與其他細(xì)菌的相互作用20
• 1.3.2.4 提高對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性20
• 1.3.3 T6SS研究進(jìn)展20-21
• 1.4 密度感應(yīng)系統(tǒng)21-22
• 1.4.1 弧菌的密度感應(yīng)系統(tǒng)21
• 1.4.2 AHL信號(hào)分子21
• 1.4.3 鰻弧菌的密度感應(yīng)系統(tǒng)21-22
• 1.5 本論文研究的目的和意義22-24
• 2 環(huán)境因子對(duì)鰻弧菌MHK3T6SS表達(dá)和分泌的影響24-38
• 引言24
• 2.1 材料和方法24-31
• 2.1.1 菌株、培養(yǎng)基、抗體、引物24-25
• 2.1.2 不同培養(yǎng)條件細(xì)菌培養(yǎng)物的制備25-26
• 2.1.3 qRT-PCR檢測(cè)26-28
• 2.1.3.1 細(xì)菌總RNA的提取26
• 2.1.3.2 消化樣品中的DNA26-27
• 2.1.3.3 RNA反轉(zhuǎn)錄27
• 2.1.3.4 qRT-PCR檢測(cè)Hcp的表達(dá)27-28
• 2.1.4 Western blot檢測(cè)Hcp的表達(dá)和分泌28-29
• 2.1.4.1 胞外和胞內(nèi)蛋白組分的制備和提取28-29
• 2.1.4.2 Western blot分析蛋白分泌和表達(dá)29
• 2.1.5 Hcp的穩(wěn)定性檢測(cè)29-30
• 2.1.6 數(shù)據(jù)分析30-31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-36
• 2.2.1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)鰻弧菌Hcp表達(dá)和分泌的影響31-32
• 2.2.2 不同鹽度對(duì)Hcp表達(dá)和分泌的影響32-33
• 2.2.3 不同pH對(duì)MHK3 Hcp表達(dá)和分泌的影響33-35
• 2.2.4 Hcp的穩(wěn)定性35-36
• 2.3 討論36-38
• 3 密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)因子luxO對(duì)鰻弧菌MHK3 T6SS表達(dá)和分泌的影響38-51
• 引言38
• 3.1 材料和方法38-44
• 3.1.1 菌株和質(zhì)粒38-40
• 3.1.2 luxO突變菌株的構(gòu)建40-43
• 3.1.2.1 原理40
• 3.1.2.2 引物設(shè)計(jì)40-41
• 3.1.2.3 luxO基因缺失片段的構(gòu)建41
• 3.1.2.4 重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建41-42
• 3.1.2.5 接合42-43
• 3.1.2.6 二次同源重組和突變株的篩選43
• 3.1.3 突變株及其野生株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定43-44
• 3.1.3.1 在TSB培養(yǎng)條件下各菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定43
• 3.1.3.2 在2216E海水培養(yǎng)條件下各菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定43-44
• 3.1.4 突變菌及野生株Hcp在不同生長(zhǎng)期分泌表達(dá)的分析44
• 3.1.4.1 qRT-PCR分析Hcp mRNA表達(dá)44
• 3.1.4.2 Western blot分析Hcp的表達(dá)和分泌44
• 3.1.5 數(shù)據(jù)分析44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-49
• 3.2.1 luxO突變菌株的鑒定44-45
• 3.2.2 突變株及其野生株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定45-47
• 3.2.3 突變菌及野生株Hcp在不同生長(zhǎng)期的表達(dá)和分泌47-49
• 3.2.3.1 qRT-PCR分析Hcp的表達(dá)47-48
• 3.2.3.2 Western blot分析Hcp的表達(dá)和分泌48-49
• 3.3 討論49-51
• 4 T6SS介導(dǎo)的鰻弧菌MHK3的抑菌作用51-61
• 引言51
• 4.1 材料和方法51-55
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株、培養(yǎng)基51-52
• 4.1.2 從海水環(huán)境中分離E.coli及利福平抗性菌株的篩選52-53
• 4.1.3 鰻弧菌與E.tarda的共培養(yǎng)體系及細(xì)菌計(jì)數(shù)53-54
• 4.1.4 鰻弧菌與E.coli的共培養(yǎng)體系及細(xì)菌計(jì)數(shù)54-55
• 4.2 結(jié)果55-58
• 4.2.1 環(huán)境中E.coli的分離及利福平抗性菌株的篩選55
• 4.2.2 鰻弧菌對(duì)E. tarda的抑制效果55-57
• 4.2.3 鰻弧菌對(duì)E. coli的抑制效果57-58
• 4.3 討論58-60
• 4.4 總結(jié)和展望60-61
• 參考文獻(xiàn)61-72
• 附錄72-75
• 致謝75-76
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷76

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2 夏永娟,黃威權(quán),金曉航,姜國(guó)良,劉云;抗鰻弧菌單克隆抗體免疫保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];海洋湖沼通報(bào);2000年03期

3 陳吉祥,于德華,李筠;魚類病原鰻弧菌致病相關(guān)因子及分子生物學(xué)[J];海洋科學(xué);2003年08期

4 夏永娟,黃寶成,溫偉紅,黃威權(quán),楊安鋼;抗鰻弧菌獨(dú)特型單克隆抗體重鏈可變區(qū)基因的克隆及序列測(cè)定[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2003年02期

5 楊鳶R，

本文編號(hào)：321211