本文關(guān)鍵詞：馬皰疹病毒1型神經(jīng)致病因子UL24基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：馬皰疹病毒1型(Equine Herpesvirus 1,EHV-1)為引起馬屬動物流產(chǎn)、癱瘓、共濟(jì)失調(diào)、神經(jīng)性腦脊髓炎的主要病原。EHV-1主要編碼6種調(diào)控蛋白,包括1個(gè)極早期蛋白(IE)、4個(gè)早期蛋白(IR2、EICP0、EICP22、EICP27)以及1個(gè)晚期蛋白(ETIF)。這些蛋白對自身病毒基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起著關(guān)鍵作用。EHV-1的76個(gè)基因中,啟動子結(jié)構(gòu)明確的只有8個(gè),分別為gK、IR5、IE、IR2、EICP0、EICP22、EICP27和ETIF,EHV-1調(diào)控蛋白對自身啟動子調(diào)控特征的研究更是十分有限。UL24基因在所有皰疹病毒科中高度保守性,其編碼的蛋白與神經(jīng)致病性密切相關(guān)。EHV-1神經(jīng)系統(tǒng)條件性致病依賴于病毒自身對UL24基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。目前,EHV-1 UL24基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)研究還未見報(bào)道,本研究以馬皰疹病毒1型(EHV-1)UL24基因(ORF37)為研究對象,研究UL24啟動子在EHV-1基因組中的精確定位以及UL24基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制等科學(xué)問題。本研究中,利用5′RACE方法,確證了UL24開放閱讀框上游的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)Tss1和Tss2,分別定位于基因組70118 bp和70397 bp;根據(jù)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)所在基因序列特征,構(gòu)建UL24啟動子報(bào)告重組質(zhì)粒(pUL24I、pUL24II-1、pUL24II-2、pUL24II-3、pUL24II-4、pUL24II-5、pUL24II-6、pUL24II-7、pUL24II-8),利用雙熒光素酶報(bào)告檢測系統(tǒng)確證了UL24I與UL24II-5分別為Tss1和Tss2對應(yīng)的啟動子,且二者所含核心元件不同,分別為TATA盒子和起始子(INR);同時(shí)克隆EHV-1調(diào)控蛋白基因,構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒(pIE、pIR2、pEICP0、pEICP22、pEICP27、pEICP27-Flag、pETIF),經(jīng)Western blotting檢測,驗(yàn)證了EHV-1調(diào)控蛋白的表達(dá);為了檢測調(diào)控蛋白對UL24啟動子活性的影響,我們通過共轉(zhuǎn)染UL24啟動子報(bào)告重組質(zhì)粒與調(diào)控蛋白真核表達(dá)重組質(zhì)粒,利用雙熒光素酶報(bào)告檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測,結(jié)果表明:EHV-1六種調(diào)控蛋白對UL24的不同的啟動子調(diào)控模式相似,啟動子UL24I和UL24II-5在EICP0蛋白作用下,活性分別升高2.3倍和17.5倍;在EICP22蛋白作用下,活性分別升高2.4倍和6倍;在ETIF蛋白作用下,活性分別升高1.8倍和4倍。與之相反,啟動子UL24I和UL24II-5在IR2蛋白作用下,活性分別下降43.4倍和26.3倍;在IE蛋白作用下,活性分別下降2.3倍和3.9倍;EICP22可與IE蛋白協(xié)同增強(qiáng)UL24I啟動子活性。同時(shí),本研究利用免疫共沉淀技術(shù)和激光共聚焦技術(shù),以EICP27蛋白為參照,探索EICP22蛋白增強(qiáng)UL24啟動子活性的機(jī)制,結(jié)果表明,EICP22蛋白增強(qiáng)UL24啟動子活性不依賴于EICP22蛋白與轉(zhuǎn)錄因子TBP間的相互作用。本研究結(jié)果揭示了UL24基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的新機(jī)制,為后續(xù)神經(jīng)條件性致病機(jī)理研究提供理論線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：馬皰疹病毒1型 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 神經(jīng)致病因子 UL24
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 英文縮略表10-11
• 第一章 引言11-19
• 1.1 馬鼻肺炎概述11-15
• 1.1.1 馬鼻肺炎11
• 1.1.2 馬皰疹病毒1型11-15
• 1.2 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控概述15-16
• 1.3 皰疹病毒UL24的研究16-17
• 1.3.1 UL24基因序列的特點(diǎn)16
• 1.3.2 UL24基因編碼蛋白的特點(diǎn)16-17
• 1.4 研究的目的與意義17-19
• 第二章 馬皰疹病毒UL24基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究19-36
• 2.1 材料和方法19-25
• 2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和病毒19
• 2.1.2 質(zhì)粒和菌株19
• 2.1.3 主要試劑19-20
• 2.1.4 主要設(shè)備儀器20
• 2.1.5 細(xì)胞總RNA的提取20-21
• 2.1.6 UL24 cDNA 5?末端全長的擴(kuò)增21
• 2.1.7 病毒DNA的提取21
• 2.1.8 引物的設(shè)計(jì)及重組質(zhì)粒的構(gòu)建21-24
• 2.1.9 Western bloting24
• 2.1.10 雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)24
• 2.1.11 激光共聚焦24-25
• 2.1.12 免疫共沉淀25
• 2.2 結(jié)果25-33
• 2.2.1 UL24轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定25-26
• 2.2.2 UL24啟動子活性的鑒定26-27
• 2.2.3 UL24啟動子元件的鑒定27-29
• 2.2.4 EHV-1 調(diào)控蛋白的表達(dá)29
• 2.2.5 調(diào)控蛋白對UL24啟動子活性的影響29-30
• 2.2.6 調(diào)控蛋白EICP22、EICP27、IE對啟動子活性的影響30-31
• 2.2.7 調(diào)控蛋白EICP22、EICP27分別與TBP的免疫共沉淀31-32
• 2.2.8 調(diào)控蛋白EICP22、EICP27分別與TBP的共定位32-33
• 2.3 討論33-36
• 第三章 全文結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-43
• 致謝43-44
• 作者簡歷44

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3 楊s

本文編號：317941