本文關鍵詞：多房棘球蚴Em95基因克隆、原核表達及應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：多房棘球蚴病俗稱泡球蚴病是由多房棘球絳蟲的幼蟲(多房棘球蚴、泡球蚴)寄生于人或動物肝臟所引起的一種人獸共患寄生蟲病,它的成蟲主要寄生于狐貍、狼和犬的小腸內。本病主要在北半球高緯度地區(qū)和凍土地帶流行,但隨著世界貿易和全球化進程的推進,該病有向南半球蔓延的趨勢。它不僅能嚴重危害人體的健康,而且還是一個嚴重的社會經濟問題。目前,對于該病的治療主要是以手術切除為主,藥物治療為輔,但是由于泡球蚴呈腫瘤樣無限浸潤生長,手術切除后能發(fā)生轉移,因此對泡球蚴病的預防成為流行區(qū)各級政府所優(yōu)先關心的問題。研究多房棘球絳蟲保護性抗原EM95的免疫保護作用對泡球蚴病疫苗研制與開發(fā)具有十分重要的意義。本研究以NCBI數據庫Em95基因序列作為參考序列設計引物,以多房棘球蚴總RNA反轉錄產物為模板進行PCR擴增,獲得Em95基因完整ORF序列,并對該序列進行了相關的生物信息學分析。結果表明,EM95蛋白的編碼基因長471 bp,與參考序列的相似性為100%,由156個氨基酸殘基組成,其上有2個N-糖基化位點,N端有一長為16個氨基酸的信號肽序列,C端有由23個氨基酸組成的跨膜區(qū),屬于分泌型糖蛋白。B細胞抗原表位分析表明,EM95有6個潛在的抗原表位,比EG95預測的抗原表位少一個。將全長的Em95基因和截去編碼信號肽及跨膜區(qū)的Em95基因分別克隆到原核表達載體中并轉化到大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細胞中,用IPTG誘導使其表達。結果表明,全長的Em95基因以包涵體形式表達,而截去信號肽及跨膜區(qū)的Em95基因(t Em95)以可溶性蛋白形式表達。將純化后的tEM95重組蛋白免疫BALB/c小鼠(雌性,6周齡),小鼠分為免疫組(首免50μg,以后減半,40只)、佐劑組(40只)和對照組(40只),三次免疫兩周后腹腔接種多房棘球蚴原頭蚴(100個/只)進行攻擊感染,9周后對試驗小鼠進行剖檢,結果表明EM95重組蛋白對小鼠的保護率為27.58%,減蚴率為60.52%~67.38%。結論認為,EM95重組蛋白對繼發(fā)性多房棘球蚴病具有一定的保護作用,能明顯抑制多房棘球蚴的生長;本研究為多房棘球蚴病EM95重組抗原疫苗的研制和開發(fā)提供了理論依據。
【關鍵詞】：多房棘球絳蟲 EM95重組蛋白 基因克隆與表達 疫苗 免疫保護作用
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.7;Q78
【目錄】：

• 附件2-6
• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 前言13-19
• 1.1 包蟲病/棘球絳蟲13-14
• 1.2 泡型包蟲病/多房棘球蚴14-16
• 1.3 EG95/EM9516-19
• 第二章 多房棘球絳蟲Em95基因克隆及序列分析19-26
• 2.1 材料與方法19-21
• 2.1.1 多房棘球蚴、菌種及試劑19
• 2.1.2 引物設計與合成19
• 2.1.3 多房棘球蚴的獲取19-20
• 2.1.4 原頭蚴總RNA提取與反轉錄20
• 2.1.5 PCR擴增多房棘球蚴Em95基因20
• 2.1.6 Em95基因的克隆及測序20
• 2.1.7 Em95基因序列分析20-21
• 2.2 結果21-25
• 2.2.1 多房棘球蚴總RNA的提取21
• 2.2.2 多房棘球絳蟲Em95基因的克隆21-22
• 2.2.3 EM95理化性質22-23
• 2.2.4 EM95信號肽及跨膜區(qū)預測23
• 2.2.5 EM95二級結構分析23-24
• 2.2.6 抗原表位預測24
• 2.2.7 三級結構預測24-25
• 2.3 討論25-26
• 第三章 多房棘球絳蟲Em95基因原核表達載體的構建及表達26-34
• 3.1 實驗材料26
• 3.1.1 載體與菌株26
• 3.1.2 主要試劑26
• 3.1.3 主要儀器26
• 3.2 實驗方法26-28
• 3.2.1 重組質粒的構建及鑒定26-27
• 3.2.2 多房棘球蚴EM95的原核表達及表達形式鑒定27-28
• 3.2.3 表達條件優(yōu)化28
• 3.2.4 重組EM95蛋白純化28
• 3.3 結果28-32
• 3.3.1 Em95基因片段的擴增28-29
• 3.3.2 重組質粒陽性鑒定（PCR）29
• 3.3.3 Em95和tEm95原核表達29-30
• 3.3.4 pET30a-tEm95重組蛋白誘導條件的優(yōu)化30-31
• 3.3.5 pET30a-tEm95重組蛋白的純化31-32
• 3.4 討論32-34
• 第四章 重組EM95蛋白免疫小鼠保護力觀察及應用34-41
• 4.1 材料與方法34-36
• 4.1.1 實驗動物、多房棘球蚴及樣品34
• 4.1.2 主要試劑及溶液34
• 4.1.3 小鼠的免疫實驗34-35
• 4.1.4 ELISA檢測EM95特異性抗體檢測35
• 4.1.5 EM95重組蛋白保護效力觀察35
• 4.1.6 EM95重組蛋白的應用35-36
• 4.2 結果36-39
• 4.2.1 ELISA檢測36-37
• 4.2.2 攻蟲實驗37
• 4.2.3 EM95重組蛋白保護力檢測37-38
• 4.2.4 EM95重組蛋白的應用38-39
• 4.3 討論39-41
• 第五章 全文結論41-42
• 參考文獻42-47
• 致謝47-48
• 作者簡歷48

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前6條

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6 李立;婁忠子;閆鴻斌;范彥雷;李建秋;殷宏;賈萬忠;;棘球屬絳蟲分子種系發(fā)生研究進展[J];中國人獸共患病學報;2014年11期

中國碩士學位論文全文數據庫 前1條

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本文編號：314742