采用RNAi技術(shù)進(jìn)行害蟲(chóng)防治是一種全新的害蟲(chóng)防治策略。V-ATP酶是昆蟲(chóng)體內(nèi)與能量轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的H+質(zhì)子泵,是維持昆蟲(chóng)生命體征的關(guān)鍵蛋白。本研究中首先對(duì)小地老虎V-ATP酶的A、B亞基進(jìn)行了全長(zhǎng)c DNA克隆,然后以B亞基為靶基因,構(gòu)建了沉默B亞基基因的桿狀病毒載體,具體結(jié)果如下:（1）采用RACE技術(shù)克隆了小地老虎V-ATP酶A亞基和B亞基的基因全長(zhǎng),并對(duì)基因進(jìn)行了分析。A亞基基因全長(zhǎng)2693bp,其中CDS區(qū)1851bp,翻譯616個(gè)氨基酸,蛋白的分子量為68.06KD;B亞基2583bp,其中CDS區(qū)1491bp,編碼496個(gè)氨基酸,蛋白的分子量為50.01KD。目前,這兩個(gè)基因已提交至基因庫(kù)中,并獲得基因登錄號(hào)（A亞基:KM434187;B亞基:KM434188）。（2）根據(jù)V-ATP酶B亞基基因序列,設(shè)計(jì)并合成了3條si RNA,注射到小地老虎3齡幼蟲(chóng)后進(jìn)行q-PCR檢測(cè)。選取干擾效果最好的si1（干擾效率44.90%）進(jìn)行后續(xù)的載體構(gòu)建。（3）轉(zhuǎn)染sf21細(xì)胞系,將小鼠U6啟動(dòng)子和B亞基sh RNA構(gòu)建到昆蟲(chóng)桿狀病毒載體p Bac PAK9中,篩選出對(duì)小地老虎V-ATP酶具有特... 

【文章來(lái)源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：78 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 前言
    1.2 RNAi
        1.2.1 RNA干擾的原理
        1.2.2 RNA干擾的特點(diǎn)
    1.3 RNA干擾介導(dǎo)的方法
        1.3.1 注射法
        1.3.2 飼喂法
        1.3.3 浸液法
        1.3.4 轉(zhuǎn)基因植物
    1.4 RNA干擾的應(yīng)用
        1.4.1 在基因治療中的應(yīng)用
        1.4.2 在基因功能研究中的應(yīng)用
        1.4.3 在植物改良中的應(yīng)用
    1.5 在昆蟲(chóng)防治中的應(yīng)用
    1.6 RNAi應(yīng)用于昆蟲(chóng)防治的問(wèn)題和展望
    1.7 小地老虎
    1.8 V-ATP酶
        1.8.1 V-ATP酶的結(jié)構(gòu)和功能
        1.8.2 昆蟲(chóng)V-ATP酶的研究進(jìn)展
    1.9 研究的目的和意義
第二章 小地老虎V-ATP酶A亞基和B亞基基因全長(zhǎng)的克隆
    2.1 前言
    2.2 材料與試劑
        2.2.1 主要試劑
        2.2.2 主要儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 小地老虎總RNA的提取
        2.3.2 特異引物設(shè)計(jì)
        2.3.3 保守序列擴(kuò)增
        2.3.4 合成 3′和 5′-RACE-Ready cDNA
        2.3.5 cDNA3′末端和 5′末端的克隆
        2.3.6 連接轉(zhuǎn)化
        2.3.7 測(cè)序拼接及CDS區(qū)的獲得
        2.3.8 基因序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化性分析
    2.4 結(jié)果分析
        2.4.1 小地老虎總RNA的提取
        2.4.2 保守序列的擴(kuò)增
        2.4.3 A亞基 3'和 5'末端的克隆
        2.4.4 B亞基 3'和 5'末端的克隆
        2.4.5 A亞基基因CDS區(qū)的克隆及序列分析
        2.4.6 B亞基基因CDS區(qū)的克隆及序列分析
    2.5 小結(jié)與討論
第三章 SiRNA的設(shè)計(jì)與篩選
    3.1 前言
    3.2 材料與試劑
        3.2.1 主要試劑與材料
        3.2.2 主要儀器
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法：
        3.3.1 SiRNA的設(shè)計(jì)合成及注射
        3.3.2 顯微注射
        3.3.3 定量引物設(shè)計(jì)
        3.3.4 干擾結(jié)果檢測(cè)
        3.3.5 定量結(jié)果分析
    3.4 結(jié)果分析
        3.4.1 定量引物標(biāo)準(zhǔn)曲線
        3.4.2 定量結(jié)果分析
    3.5 小結(jié)與討論
第四章 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建
    4.1 前言
    4.2 材料與試劑
        4.2.1 主要材料
        4.2.2 主要儀器
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 穿梭載體的構(gòu)建
        4.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.3.3 轉(zhuǎn)染并重組病毒表達(dá)載體
        4.3.4 噬斑實(shí)驗(yàn)
        4.3.5 桿狀病毒遺傳穩(wěn)定性
        4.3.6 桿狀病毒對(duì)小地老虎的干擾效果檢測(cè)
    4.4 結(jié)果分析
        4.4.1 穿梭載體的構(gòu)建
        4.4.2 重組桿狀病毒
        4.4.3 桿狀病毒遺傳穩(wěn)定性
        4.4.4 對(duì)小地老虎的干擾效果檢測(cè)
    4.5 小結(jié)與討論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
縮略詞
致謝
作者簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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