本文關(guān)鍵詞：豬札幌病毒主要非結(jié)構(gòu)蛋白的表達及VP2互作分子的篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：札幌病毒又名札如病毒,屬于杯狀病毒科札幌病毒屬,是人和動物病毒性急性胃腸炎的主要病原體之一。主要通過糞-口途徑傳播,引起輕微腹瀉或急性腹瀉并伴有惡心、嘔吐和腹痛等癥狀。近年來研究發(fā)現(xiàn),札幌病毒不僅感染人,而且感染豬、牛、狗、貓、蝙蝠、水貂和海獅等動物。豬札幌病毒最早于1980年在美國被發(fā)現(xiàn),隨后,在許多國家都發(fā)現(xiàn)了該病毒,給養(yǎng)豬業(yè)造成了一定的威脅和損失。中國最早于2008年從腹瀉豬的糞便中分離出了該病毒,隨后的研究發(fā)現(xiàn),該病毒不僅存在于腹瀉豬群中,而且在無癥狀豬群中也有一定的檢出率,存在隱性帶毒現(xiàn)象,對養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)存在潛在威脅。因此全面了解該病毒的生物學(xué)特性,探究該病毒在引起仔豬尤其是斷奶仔豬腹瀉中所起的作用,對于降低經(jīng)濟損失、保障人類健康,具有重要的意義。本研究利用原核表達系統(tǒng)獲得了豬札幌病毒CH430株VPg、3C、3D、p70和VP2 5種重組蛋白及其多克隆抗體,并利用酵母雙雜交系統(tǒng)初步篩選出23種與VP2相互作用的已知蛋白。本研究首先采用一步法RT-PCR方法分別擴增豬札幌病毒CH430株VPg、3C、3D、p70、VP2目的片段,然后將這些目的片段分別亞克隆到pET-30a載體中,分別構(gòu)建原核表達載體pET30a-VPg/3C/3D/p70/VP2,將其分別轉(zhuǎn)化到表達菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達,SDS-PAGE電泳確定得到的重組蛋白大小分別為22、23、67、81、26 kDa,五種蛋白均主要以包涵體形式存在。采用Ni Sepharose 6 Fast Flow純化體系Ni-NTA親和層析純化方法進行純化,獲得濃度和純度較高的VPg、3C、3D、p70、VP2重組蛋白,Western-blot鑒定表明VPg、3C、3D、p70、VP2重組蛋白均具有良好的抗原性;利用純化的蛋白免疫家兔制備高免血清,能夠得到高滴度的多克隆抗體,Western-blot檢測表明,五種多克隆抗體均能特異性識別相應(yīng)的重組蛋白,為進一步研究上述蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。本研究進一步以豬小腸粘膜上皮組織為模型,構(gòu)建其酵母雙雜交cDNA文庫轉(zhuǎn)化入感受態(tài)Y187酵母細(xì)胞中。以豬札幌病毒VP2基因構(gòu)建酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP2,并用醋酸鋰法將其轉(zhuǎn)化入Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中,進行毒性檢測和自激活檢測;并將含有pGBKT7-VP2的Y2HGold酵母菌與豬小腸粘膜上皮組織cDNA文庫Y187菌共培養(yǎng),然后將雜交菌液通過4缺營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基篩選陽性克隆,并進行測序,用BLAST工具對測序結(jié)果進行同源性分析。結(jié)果表明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP2中的VP2蛋白在Y2HGold中獲得表達,且不存在毒性和自激活現(xiàn)象。從豬小腸粘膜上皮組織cDNA文庫中初步篩選到23個與VP2相互作用的已知蛋白,為進一步研究豬札幌病毒VP2的功能提供了新的線索,對豬札幌病毒分子致病機制的研究具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：豬札幌病毒 克隆 原核表達 純化 酵母雙雜交
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 英文縮略表11-12
• 第一章 引言12-21
• 1.1 札幌病毒的發(fā)現(xiàn)及命名12
• 1.2 生物學(xué)分類地位12-13
• 1.3 物理特性和穩(wěn)定性13
• 1.4 基因結(jié)構(gòu)及功能13
• 1.5 基因組序列和基因分型13-14
• 1.6 基因重組14-15
• 1.6.1 主要毒株的出現(xiàn)和演變14
• 1.6.2 重組毒株14-15
• 1.7 結(jié)構(gòu)蛋白研究現(xiàn)狀15
• 1.7.1 VP1的研究現(xiàn)狀15
• 1.7.2 VP2的研究現(xiàn)狀15
• 1.8 非結(jié)構(gòu)蛋白研究現(xiàn)狀15-16
• 1.9 細(xì)胞培養(yǎng)和動物感染實驗16-17
• 1.10 傳播途徑和宿主易感性17
• 1.11 流行狀況17-18
• 1.11.1 國外流行狀況17
• 1.11.2 國內(nèi)流行狀況17-18
• 1.12 臨床癥狀18
• 1.13 受體研究18
• 1.14 檢測方法18-19
• 1.14.1 RT-PCR檢測方法19
• 1.14.2 ELISA檢測方法19
• 1.15 酵母雙雜交系統(tǒng)19-20
• 1.16 目的與意義20-21
• 第二章 PoSaV CH430株VPg、3C、3D、p70和VP2的原核表達及多抗的制備21-34
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 菌種、毒株和載體21
• 2.1.2 實驗動物21
• 2.1.3 主要試劑21-22
• 2.1.4 儀器設(shè)備22
• 2.1.5 培養(yǎng)基及溶液22-23
• 2.2 方法23-27
• 2.2.1 引物的設(shè)計與合成23
• 2.2.2 病毒總RNA的提取23-24
• 2.2.3 VPg、3C、3D、p70、VP2基因的RT-PCR擴增24
• 2.2.4 純化回收VPg、3C、3D、p70、VP2基因24
• 2.2.5 VPg、3C、3D、p70、VP2基因與pMD19-T simple載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒24
• 2.2.6 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及菌落篩選24-25
• 2.2.7 質(zhì)粒DNA提取25
• 2.2.8 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定及目的基因序列測定25
• 2.2.9 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建25-26
• 2.2.10 VPg、3C、3D、p70、VP2蛋白表達26
• 2.2.11 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳鑒定26
• 2.2.12 重組蛋白的可溶性分析26
• 2.2.13 重組蛋白的純化26-27
• 2.2.14 兔源多抗的制備27
• 2.2.15 Western-blot分析27
• 2.2.16 ELISA測定超免疫血清的效價27
• 2.3 結(jié)果與分析27-32
• 2.3.1 VPg、3C、3D、p70、VP2基因的RT-PCR擴增27-28
• 2.3.2 重組pMD19T-VPg/3C/3D/p70/VP2質(zhì)粒的鑒定28
• 2.3.3 重組原核表達載體pET30a-VPg/3C/3D/p70/VP2的鑒定28-29
• 2.3.4 重組蛋白的鑒定29-30
• 2.3.5 重組蛋白的可溶性分析30
• 2.3.6 重組蛋白的純化30-31
• 2.3.7 Western-blot鑒定31-32
• 2.3.8 抗體效價的檢測32
• 2.4 討論32-34
• 第三章 酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與VP2相互作用的宿主蛋白34-43
• 3.1 材料34
• 3.1.1 實驗動物34
• 3.1.2 菌株、表達載體及文庫34
• 3.1.3 主要試劑34
• 3.2 方法34-36
• 3.2.1 cDNA文庫的構(gòu)建34-35
• 3.2.2 VP2蛋白基因的引物設(shè)計35
• 3.2.3 VP2蛋白基因的PCR擴增35
• 3.2.4 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP2的構(gòu)建35
• 3.2.5 酵母雙雜交試驗35-36
• 3.3 結(jié)果與分析36-40
• 3.3.1 豬小腸上皮組織總RNA的提取及均一化cDNA文庫的構(gòu)建36-37
• 3.3.2 豬小腸粘膜上皮組織cDNA文庫的鑒定37-38
• 3.3.3 誘餌蛋白VP2的毒性檢測和自激活檢測38-39
• 3.3.4 酵母雙雜交篩選豬小腸粘膜上皮組織cDNA文庫39
• 3.3.5 陽性克隆測序結(jié)果39-40
• 3.4 討論40-43
• 第四章 全文結(jié)論43-44
• 參考文獻44-51
• 致謝51-52
• 作者簡歷52

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 常昭瑞;靳淼;劉娜;謝華萍;崔淑嫻;章青;段招軍;;我國九省區(qū)2006年札如病毒流行狀況及基因序列分析[J];病毒學(xué)報;2009年02期

2 吳芳姿;江大雄;莫之欣;;臺灣地區(qū)首例沙波病毒腹瀉群聚感染事件[J];海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2008年02期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 吳劉亦文;顳葉癲癇大鼠模型PSD中SNX3的表達[D];中南大學(xué);2009年

  本文關(guān)鍵詞：豬札幌病毒主要非結(jié)構(gòu)蛋白的表達及VP2互作分子的篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：310351