哺乳動物精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜而精密的過程,由很多基因參與調(diào)控,對雄性動物的繁殖性能具有重要影響。磷酸甘油酸變位酶1（phosphoglycerate mutase 1,PGAM1）和磷酸丙糖異構(gòu)酶1（triosephosphate isomerase 1,TPI1）是糖酵解代謝過程中的關(guān)鍵酶。睪丸支持細(xì)胞可通過糖酵解途徑為生精細(xì)胞的發(fā)育提供能量底物。因而探究PGAM1和TPI1基因在雄性藏綿羊生殖器官中的表達(dá)及生物學(xué)功能對深入理解其調(diào)控機(jī)制具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)以性成熟前（3月齡）、性成熟（1歲）和成年（3歲）3個(gè)較為關(guān)鍵發(fā)育期的雄性藏綿羊生殖器官作為試驗(yàn)材料,克隆了PGAM1和TPI1基因的完整CDS區(qū)序列,進(jìn)行生物信息學(xué)分析;采用qRT-PCR和Western blot方法從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測了藏綿羊生殖器官中PGAM1和TPI1 mRNA和蛋白表達(dá)量,運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色法檢測PGAM1和TPI1蛋白在不同年齡藏綿羊睪丸和附睪組織內(nèi)表達(dá)定位,初步探究了PGAM1和TPI1對雄性藏綿羊生殖器官中的影響。主要研究結(jié)果如下:1.藏綿羊PGAM1基因CDS區(qū)全長為765 bp,可編碼254... 

【文章來源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

哺乳動物睪丸支持細(xì)胞糖酵解代謝通路Figure1-1GlycolysispathwayintesticularSertolicellsofmammals

，PTU）誘導(dǎo)的甲狀腺功能減退癥的小鼠睪丸中，葡糖糖的攝入量，GLUT3和GLUT8的表達(dá)量，LDH的活性及睪丸內(nèi)乳酸的濃度均明顯降低，生殖細(xì)胞的凋亡率增加，增殖率降低。說明患甲狀腺功能減退癥的性成熟前小鼠睪丸內(nèi)通過增加氧化應(yīng)激（抑制糖酵解過程）來影響生殖細(xì)胞的存活和增殖。Verma和Krishna[31]的研究結(jié)果表明，由來曲唑誘導(dǎo)的小鼠睪丸中E濃度的下降可能導(dǎo)致胰島素受體（Insulinreceptor，IR）表達(dá)水平下降，進(jìn)而降低了睪丸內(nèi)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)速度，經(jīng)糖酵解產(chǎn)生的乳酸量降低，細(xì)胞的增殖率和存活率下降，凋亡率增加。圖1-2差異表達(dá)蛋白的KEGG富集結(jié)果Figure1-2ResultsofKEGGenrichmentofthedifferentiallyexpressedproteins2磷酸甘油酸變位酶2.1磷酸甘油酸變位酶糖酵解是生物體中糖氧化分解三大途徑之一。糖酵解通過多種催化酶（醛縮

藏綿羊PGAM1和TPI1基因的克隆及在雄性生殖器官中的表達(dá)13軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性比對分析。利用MEGA7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)生樹，其中氨基酸比對及進(jìn)化樹構(gòu)建中各物種氨基酸序列均來自NCBI數(shù)據(jù)庫。2結(jié)果與分析2.1PGAM1和TPI1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果藏綿羊PGAM1和TPI1基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得了與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符的特異性目的片段(圖2-1)�？寺〉玫搅似伍L度分別為765bp和861bp的核苷酸序列。圖2-1PGAM1和TPI1基因的PCR檢測結(jié)果Figure2-1PCRamplificationofPGAM1andTPI1geneM:DNALadder2000Marker(5μL);1~2:PGAM1；3~4:TPI12.2生物信息學(xué)分析經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，PGAM1與用于設(shè)計(jì)克隆引物的序列的相似度為99.74%（第132位堿基T→G，第708位堿基A→G）（圖2-2）；TPI1與用于設(shè)計(jì)克隆引物的序列的相似度為99.88%（第833位堿基C→T）（圖2-3），且均為同義突變。通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的ORFFinder在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，在PGAM1克隆序列中存在一個(gè)最長的ORF區(qū)（1-765bp）；藏綿羊PGAM1基因的CDS區(qū)全長為765bp，編碼254個(gè)氨基酸（起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA）；TPI1基因

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3090486