鴨、鵝等水禽均為我國主要的養(yǎng)殖禽類,占全世界總量的75.0%。但是,鴨的病毒病對我國養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重的危害,并引發(fā)一系列公共衛(wèi)生安全問題。高遷移率族蛋白B2（HMGB2）是一種高度保守的核蛋白,廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,其表達(dá)水平能發(fā)揮促炎作用,成為近年來危重醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。HMGB2有黏性能并且和細(xì)胞表面相異的分子進(jìn)行結(jié)合,是一個(gè)具有高親和力受體。HMGB2在病毒核酸誘導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)中能發(fā)揮哨兵作用,但是如細(xì)胞中無HMGB2,細(xì)胞是否被病毒感染缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。所以,本研究進(jìn)而系統(tǒng)的對鴨HMGB2（duHMGB2）在宿主抗鴨瘟病毒感染先天性免疫中的作用進(jìn)行了研究,內(nèi)容主要分為三個(gè)部分:第一部分duHMGB2基因的擴(kuò)增與序列分析根據(jù)預(yù)測的duHMGB2的基因序列設(shè)計(jì)鑒定引物,然后再提取櫻桃谷肉鴨的脾臟組織RNA,通過反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA模板,最后使用特異性引物（duHMGB2-F1/R1）通過擴(kuò)增從而得到所需要的目的片段,然后通過測序后得到蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDs）由624bp組成,編碼207個(gè)氨基酸,其分子量約為24kDa。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果發(fā)現(xiàn),本研究克隆的duHMGB2序列與原... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：45 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

HMGB2在健康鴨組織中的表達(dá)

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士專業(yè)學(xué)位論文21圖3鴨組織中病毒感染檢測結(jié)果比果。使用2-ΔΔCT方法以GAPDH作為內(nèi)參基因并且以平均對照值作為基線參考來計(jì)算基因表達(dá)的倍數(shù)變化。數(shù)據(jù)表示為三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SE。Fig.3comparisonofresultsofvirusinfectiondetectioninducktissues.Fold-changesingeneexpressionwerecalculatedusingthe2-ΔΔCTmethodwithGAPDHservingasanormalizationgeneandmeancontrolvaluesasbaselinereference.Dataarerepresentedasthemeanvalue±SEofthreeexperiments.3.4duHMGB2轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞后的WesternBlot檢測結(jié)果比較將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到DEF細(xì)胞24hpi后，收集細(xì)胞進(jìn)行WesternBlot檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，目的條帶約為25kDa符合預(yù)期大小，這表明：重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0（+）-duHMGB2-Flag能在DEF中成功表達(dá)。圖4HMGB2轉(zhuǎn)染DEF后的WesternBlot檢測結(jié)果比較。duhmgb-2重組質(zhì)粒在25kDa出現(xiàn)條帶Figure4ComparisonofWesternBlottestresμLtsafterHMGB2transfectionwithDEF.Thebandsofduhmgb-2recombinantplasmidappearedat25kDa3.5雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果將pcDNA3.0（+）-duHMGB2-Flag（500ng/孔）與100ng/孔的報(bào)告質(zhì)粒（pGL3-NF-κB與pGL3-IRF7）與50ng/孔pRL-TK質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞；48hpt時(shí)收集細(xì)胞樣品并測量熒光素酶活性，結(jié)果表明：duHMGB2轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞后NF-κB啟動(dòng)子活性高于對照組細(xì)胞5.68倍（P<0.05）；而IRF-7啟動(dòng)子活性實(shí)驗(yàn)組與對照組相比沒有明顯變化。這表明duHMGB2過表達(dá)可能激活NF-κB信號通路。見圖5。

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士專業(yè)學(xué)位論文21圖3鴨組織中病毒感染檢測結(jié)果比果。使用2-ΔΔCT方法以GAPDH作為內(nèi)參基因并且以平均對照值作為基線參考來計(jì)算基因表達(dá)的倍數(shù)變化。數(shù)據(jù)表示為三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SE。Fig.3comparisonofresultsofvirusinfectiondetectioninducktissues.Fold-changesingeneexpressionwerecalculatedusingthe2-ΔΔCTmethodwithGAPDHservingasanormalizationgeneandmeancontrolvaluesasbaselinereference.Dataarerepresentedasthemeanvalue±SEofthreeexperiments.3.4duHMGB2轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞后的WesternBlot檢測結(jié)果比較將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到DEF細(xì)胞24hpi后，收集細(xì)胞進(jìn)行WesternBlot檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，目的條帶約為25kDa符合預(yù)期大小，這表明：重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0（+）-duHMGB2-Flag能在DEF中成功表達(dá)。圖4HMGB2轉(zhuǎn)染DEF后的WesternBlot檢測結(jié)果比較。duhmgb-2重組質(zhì)粒在25kDa出現(xiàn)條帶Figure4ComparisonofWesternBlottestresμLtsafterHMGB2transfectionwithDEF.Thebandsofduhmgb-2recombinantplasmidappearedat25kDa3.5雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果將pcDNA3.0（+）-duHMGB2-Flag（500ng/孔）與100ng/孔的報(bào)告質(zhì)粒（pGL3-NF-κB與pGL3-IRF7）與50ng/孔pRL-TK質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞；48hpt時(shí)收集細(xì)胞樣品并測量熒光素酶活性，結(jié)果表明：duHMGB2轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞后NF-κB啟動(dòng)子活性高于對照組細(xì)胞5.68倍（P<0.05）；而IRF-7啟動(dòng)子活性實(shí)驗(yàn)組與對照組相比沒有明顯變化。這表明duHMGB2過表達(dá)可能激活NF-κB信號通路。見圖5。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]鴨瘟病毒感染的診斷與病毒分離鑒定[J]. 李小倫.  中國動(dòng)物保健. 2018(01)
[2]高遷移率族蛋白HMGB2的細(xì)胞內(nèi)定位及移位研究[J]. 王娟,劉錚,徐佳,張秀娟,伍麗瓊,鄧鵬,姜勇.  解放軍醫(yī)學(xué)雜志. 2009(04)
[3]高遷移率族蛋白與真核基因表達(dá)調(diào)控[J]. 徐佳,劉志鋒,姜勇.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2005(05)
[4]鴨瘟病毒的研究[J]. 黃引賢,歐守杼,鄺榮祿,林維慶.  華南農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào). 1980(01)

博士論文
[1]鴨瘟病毒中國強(qiáng)毒株基因組解析及UL55基因功能初步研究[D]. 吳英.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015

碩士論文
[1]鴨半乳糖凝集素-1在宿主抗鴨瘟病毒感染中的作用研究[D]. 韓少杰.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019
[2]鴨瘟病毒SDWF株的分離鑒定及致病性研究[D]. 張坤.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012



本文編號：3057767