發(fā)布時間：2021-02-27 14:14

　　鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus, DuCV）是目前發(fā)現(xiàn)的最小的鴨病毒,DuCV感染后可造成鴨生長遲緩,體重下降等癥狀。迄今為止,對DuCV的致病機制仍不完全清楚,圓環(huán)病毒感染通常與淋巴組織損傷有關,并且可以引起宿主淋巴細胞凋亡。因此,研究鴨圓環(huán)病毒在人工感染雛鴨體內(nèi)的侵染分布、組織病理學觀察及其致凋亡作用對DuCV致病機制探討具有十分重要的科學意義。1.實時熒光定量PCR檢測鴨圓環(huán)病毒方法的建立及半數(shù)感染量的確定為定量檢測DuCV在感染鴨體內(nèi)侵染分布的研究,根據(jù)NCBI最新公布的所有DuCV序列,比對找出保守區(qū)并設計引物,構建包含rep目的基因片段的標準質粒,成功建立特異、敏感的檢測DuCV-rep基因的qPCR方法。該建立的qPCR法檢測鴨疫里默氏桿菌、致病性大腸桿菌等的基因組模板均無交叉反應,對DuCV特異性反應良好,并且最高檢測靈敏度達9.23×101copies/μL,每個梯度之間Cq值標準偏差（SD）在0.16-0.30之間,變異系數(shù)（CV）在0.79-1.64之間,重復性良好。此外,通過制備DuCV陽性病料懸液,并對病懸液進行病毒的絕對定量,然后用不同病毒拷貝數(shù)... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
符號說明
第一部分 文獻綜述
    第一章 鴨圓環(huán)病毒致病性研究進展
        1 發(fā)現(xiàn)及病原學
        2 檢測方法
        3 致病機制
        4 小結
第二部分 試驗研究
    第二章 實時熒光定量PCR檢測鴨圓環(huán)病毒方法的建立及半數(shù)感染量的確定
        1 材料
            1.1 病料及毒株來源
            1.2 主要試劑及相關配制試劑
            1.3 主要儀器
        2 方法
            2.1 qPCR標準質粒的構建
                2.1.1 引物設計
                2.1.2 qPCR標準質粒目的片段的擴增
                2.1.3 擴增產(chǎn)物的純化及其與載體的連接
                2.1.4 感受態(tài)細胞的制備
                2.1.5 連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞
                2.1.6 陽性重組質粒的鑒定及濃度測定
            2.2 DuCV特異性qPCR方法的建立
                2.2.1 qPCR的引物設計
                2.2.2 qPCR反應退火溫度的優(yōu)化
                2.2.3 標準曲線的建立
                2.2.4 qPCR方法的敏感性試驗
                2.2.5 qPCR方法的特異性試驗
                2.2.6 qPCR方法的重復性試驗
            2.3 DuCV半數(shù)感染量的測定
        3 結果
            3.1 標準質粒pEASY-T1-rep的構建
                3.1.1 標準質粒中Rep全長片段的擴增
                3.1.2 菌落PCR鑒定
                3.1.3 重組質粒pEASY-T1-rep酶切鑒定
                3.1.4 重組質粒pEASY-T1-rep測序分析
            3.2 DuCV特異性qPCR方法的建立
                3.2.1 qPCR反應退火溫度的優(yōu)化
                3.2.2 標準曲線的建立
                3.2.3 qPCR方法的敏感性試驗
                3.2.4 qPCR方法的特異性試驗
                3.2.5 qPCR方法的重復性試驗
            3.3 DuCV半數(shù)感染量的測定
        4 討論
            4.1 DuCV特異性qPCR檢測方法的建立
            4.2 DuCV半數(shù)感染量的測定
        5 小結
    第三章 熒光定量分析鴨圓環(huán)病毒在人工感染雛鴨體內(nèi)的侵染分布及組織病理學觀察的研究
        1 材料
            1.1 毒株
            1.2 試驗動物
            1.3 主要試劑及相關配制試劑
            1.4 主要儀器
        2 方法
            2.1 DuCV人工感染雛鴨及樣本采集
                2.1.1 樣品的處理
            2.2 雛鴨人工感染DuCV疾病模型的臨床癥狀
            2.3 雛鴨人工感染DuCV疾病模型的剖檢觀察
            2.4 雛鴨人工感染DuCV疾病模型的組織病理學觀察
                2.4.1 載玻片和蓋玻片的處理
                2.4.2 雛鴨人工感染DuCV疾病模型的組織病理學觀察
            2.5 qPCR方法檢測DuCV在人工感染雛鴨后體內(nèi)的分布
        3 結果
            3.1 雛鴨人工感染DuCV疾病模型的臨床癥狀
            3.2 雛鴨人工感染DuCV疾病模型的剖檢觀察
            3.3 雛鴨人工感染DuCV疾病模型的組織病理學觀察
                3.3.1 胸腺
                3.3.2 脾臟
                3.3.3 法氏囊
                3.3.4 肝臟
                3.3.5 腎臟
            3.4 qPCR法檢測各組織器官DuCV的動態(tài)分布變化
                3.4.1 DuCV在接種鴨免疫器官中的動態(tài)分布
                3.4.2 DuCV在接種鴨消化器官中的動態(tài)分布
                3.4.3 DuCV在接種鴨消化道中的動態(tài)分布
                3.4.4 DuCV在接種鴨呼吸道中的動態(tài)分布
                3.4.5 DuCV在接種鴨其他組織器官中的動態(tài)分布
        4 討論
            4.1 雛鴨人工感染DuCV疾病模型的病理學檢測
            4.2 qPCR法檢測人工感染DuCV在雛鴨各組織器官的分布
        5 小結
    第四章 人工感染鴨圓環(huán)病毒致雛鴨免疫器官細胞凋亡的動態(tài)研究
        1 材料
            1.1 毒株
            1.2 試驗動物
            1.3 主要試劑及配制
            1.4 主要儀器及設備
        2 方法
            2.1 人工感染試驗
            2.2 兔抗鴨圓環(huán)病毒Cap蛋白IgG的純化
            2.3 免疫組化法檢測組織中DuCV抗原的分布變化
                2.3.1 兩步法免疫組化法條件優(yōu)化
                2.3.2 特異性試驗
                2.3.3 免疫組化試驗
            2.4 TUNEL法檢測組織切片細胞凋亡
        3 結果
            3.1 免疫組化法條件優(yōu)化
            3.2 特異性試驗
            3.3 免疫組化法檢測組織中DuCV抗原的分布變化
            3.4 人工感染雛鴨后不同組織的動態(tài)凋亡變化
        4 討論
        5 小結
參考文獻
致謝
附錄
作者簡介
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文


【參考文獻】：
期刊論文
[1]鴨圓環(huán)病毒巢式PCR檢測方法的建立及應用[J]. 柴順秀.  中國畜牧獸醫(yī). 2013(06)
[2]鴨圓環(huán)病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J]. 趙光遠,謝芝勛,謝麗基,龐耀珊,鄧顯文,劉加波,范晴.  畜牧與獸醫(yī). 2013(01)
[3]Epidemiological Investigation and Genome Analysis of Duck Circovirus in Southern China[J]. Chun-he Wan,Guang-hua Fu,Shao-hua Shi,Long-fei Cheng,Hong-mei Chen,Chun-xiang Peng,Su Lin and Yu Huang (Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013,China).  Virologica Sinica. 2011(05)
[4]鴨圓環(huán)病毒抗體的間接ELISA檢測方法的建立[J]. 蘇小東,曹瑞兵,張羽,劉文娟,陳昊,祝長青,陳溥言.  南京農(nóng)業(yè)大學學報. 2011(05)
[5]鴨圓環(huán)病毒套式PCR檢測方法的建立[J]. 蔡銳,張小飛,潘玲,胡來根,毛火云,尹秀鳳,黃顯明.  中國畜牧獸醫(yī). 2010(07)
[6]1例雛鴨肝炎病毒和鴨圓環(huán)病毒混合感染的診治[J]. 李威,李學奇,何金箭.  畜牧與獸醫(yī). 2008(11)
[7]PCR Detection and Sequence Analysis of Duck Circovirus in Sick Muscovy Ducks[J]. Shi-jin JIANG 1, Xing-xiao ZHANG 1, Shao-ning LIU 1, Yu WANG 2, Yi-bo KONG 1, Xiu-li WEI1, Ya-ni SUN1 and Qin ZHAO1 (1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Tai’an, 271018, China; 2. Department of Basic Medical Sciences, Taishan Medical College, Tai’an, 271000 ,China).  Virologica Sinica. 2008(04)

碩士論文
[1]鴨圓環(huán)病毒ORF3基因的序列分析及基因表達[D]. 魏宗.山東農(nóng)業(yè)大學 2011
[2]鴨圓環(huán)病毒的流行病學調(diào)查[D]. 劉少寧.山東農(nóng)業(yè)大學 2009



本文編號：3054350