堿性螺旋-環(huán)-螺旋（Basic helix-loop-helix,bHLH）轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中高度保守的一類轉(zhuǎn)錄因子,參與調(diào)控多種植物致病真菌的分生孢子產(chǎn)生與發(fā)育、菌絲形態(tài)和致病力等過程。鏈格孢（Alternaria alternata）侵染煙草引起的赤星病是煙草生產(chǎn)上的一種重要的葉部病害,條件適宜時可引起暴發(fā)性危害,導(dǎo)致煙葉品質(zhì)下降,香氣質(zhì)差,香氣量少,刺激性和雜氣增加,已成為煙草優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的一大障礙。本研究從鏈格孢中克隆了bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族,共得到12個基因,分別命名為AabHLH1^AabHLH12。分析發(fā)現(xiàn)這12個bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因編碼氨基酸長度差異較大,且同源性很低,但它們都存在一個共同的bHLH結(jié)構(gòu)域,且該結(jié)構(gòu)域位置不固定,有些分布在氨基端,有些分布在中間位置,還有的距離羧基端更近。利用Linear minimum element法和PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法獲得了AabHLH1^AabHLH4的基因插入突變體（M1^M4）,并對四個突變體進(jìn)行了回補(bǔ)。通過對比各突變體與野生菌和回補(bǔ)體之間的差異,進(jìn)行了Aa... 

【文章來源】： 楊然 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

打靶載體構(gòu)建示意圖

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文13因組DNA為模板，擴(kuò)增4個基因編碼區(qū)以及自身啟動子區(qū)域片段。PCR體系和程序與表2、3一致。（2）將四個片段和帶有氯嘧磺隆抗性的質(zhì)粒pCB1532使用SpeI和NotI進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物分別用T4連接酶進(jìn)行連接，得到回補(bǔ)載體pCB1532-AabHLH（1~4），將得到的回補(bǔ)載體送至生物工程公司進(jìn)行測序。（3）將測序正確的回補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化到4個基因插入突變體的原生質(zhì)體中，利用250μg·mL-1潮霉素B和5μg·mL-1氯嘧磺隆進(jìn)行初步篩眩（4）利用反轉(zhuǎn)錄PCR，分別以AabHLH（1~4）-CF和AabHLH（1~4）-CR為引物，4個回補(bǔ)體DNA為模板，進(jìn)行鑒定4個基因的表達(dá)。PCR體系和程序與表2、3一致。圖2回補(bǔ)體示意圖Fig.2Schematicdiagramofcomplement2.2.124個基因插入突變體的生物學(xué)表型測定2.2.12.14個基因插入突變體菌落表型觀察及生長測定將鏈格孢野生菌YS-16、4個基因插入突變體（M1、M2、M3、M4）和其回補(bǔ)菌株（C1、C2、C3、C4）活化3~5d后，分別從鏈格孢野生菌YS-16、4個基因插入突變體和其回補(bǔ)菌株的菌落邊緣取直徑9mm的菌絲塊，接種到PDA和MM培養(yǎng)基上，25℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d，觀察菌落形態(tài)并測量菌落直徑。每個菌株設(shè)3個重復(fù)，實驗重復(fù)3次。采用EXCEL記錄數(shù)據(jù)，計算數(shù)據(jù)的均值及標(biāo)準(zhǔn)差及作圖，用SPSS22.0進(jìn)行方差分析，下同。

鏈格孢（Alternaria alternata）b HLH 轉(zhuǎn)錄因子家族基因的克隆及功能研究 3 結(jié)果與分析 3.1 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族 12 個基因的克隆及分析 3.1.1 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族 12 個基因的克隆 分別以鏈格孢菌野生型菌株 YS-16 的 DNA 和 RNA 為模板，以表 1 所示序列為引物，對其 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族 12 個基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖 3 所示。 1 2 3 4 5 6 7M 8à@J 9 10 6 11 6 12 6


本文編號：3000184