本文關(guān)鍵詞：水稻抗病基因人工進化的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：利用抗性基因培育抗性品種是防治水稻病蟲害最直接、環(huán)保、經(jīng)濟、有效的方法。但目前水稻可利用R基因數(shù)量較少,且多數(shù)為等位變異基因,過度利用這些抗性基因會引起病原菌快速進化,將導(dǎo)致基因抗性功能的喪失。因此,需要不斷挖掘新的抗性基因,豐富抗性基因資源。同時要對抗病基因的結(jié)構(gòu)和功能特點及病原物進化的特點進行研究,進而達到可以通過人為地設(shè)計和創(chuàng)造抗性基因來提高品種抗性的目的。對CC-NBS-LRR抗性基因作用模式研究表明,LRR通常參與病原物的識別和NB-LRR蛋白功能的開啟與關(guān)閉,而CC-NB-ARC結(jié)構(gòu)域則可能會出現(xiàn)自激活的現(xiàn)象。同時,R基因異源表達和PRR基因間嵌合構(gòu)建的研究表明,結(jié)構(gòu)域在物種間和物種內(nèi)都有一定的保守性和融合性�；谶@種保守性和融合性,我們將白葉枯抗性基因Xa21D和稻瘟病基因Pi36、Pb1、Pita的保守功能域進行劃分和相互融合,構(gòu)建新的抗性基因,同時將Xa21D GC-Rich Region進行變異,構(gòu)成不完整的Xa21D進行轉(zhuǎn)基因功能驗證。希望通過對稻瘟病和白葉枯病的抗性鑒定,可以有效地探尋Xa21D控制功能關(guān)鍵結(jié)構(gòu)或元件,以及四個抗性基因LRR與CC-NB-ARC或Signal Sequence-GC-rich region作用特點,為進一步研究作用機制提供一定研究基礎(chǔ)。同時也可以探索這種基因嵌合方式實現(xiàn)廣譜和高效地白葉枯病和稻瘟病融合免疫反應(yīng)的可能。取得以下初步結(jié)果：1、根據(jù)文獻分析和網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果,將Xa21D的結(jié)構(gòu)域劃分為Signal Sequence、 GC-rich region和LRR region三部分,Pb1、Pi36和Pita的結(jié)構(gòu)CC-NB-ARC、Link /Spacer和LRR region三部分。將四個基因按照驗證結(jié)構(gòu)域功能和創(chuàng)制廣譜白葉枯病和稻瘟病的目的,設(shè)計了8個結(jié)構(gòu)域來源不同的嵌合抗病基因。2、按照設(shè)計要求,成功從四個抗病基因的擴增需要的片段,利用Overlap-PCR將片段按照設(shè)計要求進行拼接,獲得了8個嵌合體的全長片段,并成功將其構(gòu)建到植物表達載體PHB中。以水稻粳稻品種TP309作為受體材料,進行水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。目前獲得了RiLP2403、RiLP2406和RiLP2407的轉(zhuǎn)基因To代陽性植株,目前其他嵌合體基因仍在遺傳轉(zhuǎn)化中。3、分別對RiLP2403、RiLP2406和RiLP2407三個嵌合體基因的轉(zhuǎn)基因陽性植株進行了初步的稻瘟病抗性鑒定,結(jié)果表明三個基因均表現(xiàn)出一定的稻瘟病抗性功能,說明三個嵌合體中有結(jié)構(gòu)域起免疫功能。4、RiLP2403表現(xiàn)出對稻瘟病菌株有明顯的抗感差異,說明Pi36 LRR可能參與了稻瘟病效應(yīng)因子的識別,但尚不能確定其通過間接,還是直接的識別方式。而Xa21D Signal Sequence和GC-Rich未知區(qū)域具有可能也是參與免疫反應(yīng)的重要成分,特別是GC-Rich區(qū)域。5、而RiLP2406和RiLP2407鑒定結(jié)果不能明確其作用結(jié)構(gòu)域,但可以推測出一些較為可靠的線索。特別是,RiLP2406是由來自于Pi36的CC-NB-ARC區(qū)域,Xa21 D的GC-Rich未知區(qū)域和LRR區(qū)域構(gòu)成,具有抗白葉枯和稻瘟病兩種病害抗性的可能,需要進一步的進行稻瘟病和白葉枯病的鑒定才能明確。本研究利用抗病基因結(jié)構(gòu)域的保守型和融合性特點,將白葉枯病抗性基因Xa21D和稻瘟病抗性基因Pbl,Pi36和Pita各功能域進行劃分和融合。獲得8個結(jié)構(gòu)域來源不同的嵌合抗病基因,通過轉(zhuǎn)基因驗證了部分功能域在抗性反應(yīng)中的功能,鑒定結(jié)果表明,部分嵌合基因表現(xiàn)出稻瘟病抗性功能,并且有實現(xiàn)廣譜白葉枯病和稻瘟病融合免疫反應(yīng)的可能。表明利用抗性基因結(jié)構(gòu)域的保守性和融合性來設(shè)計新的抗性基因可能是一種潛在的有效方法。
【關(guān)鍵詞】：水稻 稻瘟病 抗病基因嵌合體 轉(zhuǎn)基因
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S511
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 文獻綜述11-27
• 1.1 植物先天免疫系統(tǒng)11-16
• 1.1.1 病原相關(guān)分子模式激發(fā)的反應(yīng)(PTI)11-12
• 1.1.2 效應(yīng)因子引發(fā)的免疫反應(yīng)(ETI)12-14
• 1.1.3 Xa21和Pi-d2介導(dǎo)的抗性14
• 1.1.4 植物系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)14-16
• 1.2 抗病基因結(jié)構(gòu)與功能16-20
• 1.2.1 R基因結(jié)構(gòu)特點16
• 1.2.2 NB-LRR基因的結(jié)構(gòu)特點16-20
• 1.3 稻瘟病抗性基因的概述20-22
• 1.4 白葉枯病抗性基因的概述22-24
• 1.5 廣譜抗性的工程探索24-25
• 1.6 立題依據(jù)與研究意義25-27
• 2 試驗材料與方法27-33
• 2.1 試驗材料27
• 2.1.1 水稻材料與稻瘟病菌株27
• 2.1.2 試驗的目的抗性基因27
• 2.1.3 表達載體與菌株27
• 2.1.4 常用基因工程使用的試劑27
• 2.2 試驗方法27-33
• 2.2.1 序列分析27-28
• 2.2.2 嵌合片段的構(gòu)建28-29
• 2.2.3 表達載體連接29-30
• 2.2.4 水稻遺傳轉(zhuǎn)化30-32
• 2.2.5 稻瘟病菌的培養(yǎng)與接種鑒定32-33
• 3 試驗結(jié)果與分析33-44
• 3.1 水稻4個基因的結(jié)構(gòu)分析33
• 3.2 抗病基因嵌合體設(shè)計結(jié)果33-37
• 3.2.1 Xa21D功能缺失序列的設(shè)計33-34
• 3.2.2 XA21D與Pita、Pi36和Pb1 LRR區(qū)域的交換34-35
• 3.2.3 CC-NB-ARC的替換35-36
• 3.2.4 NB-LRR蛋白LRR結(jié)構(gòu)域的交換36-37
• 3.3 表達載體的構(gòu)建37-38
• 3.4 遺傳轉(zhuǎn)化植株的獲得38-40
• 3.5 稻瘟病的抗性初步研究40-44
• 3.5.1 RiLP240340-42
• 3.5.2 RiLP240642-43
• 3.5.3 RiLP240743-44
• 4 討論44-46
• 4.1 本研究可行性評價44
• 4.2 本研究的不足44-45
• 4.3 嵌合蛋白的穩(wěn)定性45-46
• 5 后續(xù)研究設(shè)想46-47
• 參考文獻47-53
• 致謝53

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