羊快疫（Braxy）是由腐敗梭菌引起的急性、致死性傳染病。腐敗梭菌（Clostridium septicum）是一種革蘭氏陽(yáng)性菌,該菌感染人和家畜引起惡性水腫,因此曾被稱(chēng)為惡性水腫病。羊快疫以發(fā)病急、死亡快且感染初期癥狀不明顯為主要特征,對(duì)人類(lèi)健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。因此,迫切需要建立一種針對(duì)羊快疫等腐敗梭菌病的快速診斷方法,以便應(yīng)用于基層生產(chǎn),從而做到及時(shí)有效防治。同時(shí),疫苗免疫是針對(duì)腐敗梭菌病有效的預(yù)防措施,研發(fā)更加有效的疫苗對(duì)于此病的防控至關(guān)重要。因此本研究根據(jù)腐敗梭菌生長(zhǎng)繁殖特性,發(fā)明了一種新型的腐敗梭菌培養(yǎng)方法。在此基礎(chǔ)上,制備了腐敗梭菌多克隆抗體,建立膠體金試紙條檢測(cè)方法;并制備了腐敗梭菌類(lèi)毒素疫苗,為羊快疫的診斷和防控提供技術(shù)支持。研究?jī)?nèi)容可分為以下三個(gè)部分:1、腐敗梭菌新型培養(yǎng)方法的建立根據(jù)腐敗梭菌生長(zhǎng)培養(yǎng)需要,設(shè)計(jì)腐敗梭菌培養(yǎng)基,接種腐敗梭菌參考株（ATCC12464）,并置于不同氣體環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng),對(duì)不同時(shí)間下腐敗梭菌增菌情況進(jìn)行OD_600nm測(cè)定。最終確定培養(yǎng)基成分和配比,并發(fā)現(xiàn)在一定混合氣體配比條件下,且pH為7.8時(shí),腐敗梭菌菌體培... 

【文章來(lái)源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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腐敗梭菌革（在相同環(huán)境條件下：A：腐敗梭菌在厭氣肉肝湯培養(yǎng)基

腐敗梭菌膠體金試紙條檢測(cè)方法的建立及類(lèi)毒素疫苗的制備和應(yīng)用22OD600(A)=1.055；OD600(B)=1.981。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的厭氣肉肝湯培養(yǎng)基相比，自制培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)腐敗梭菌濃度更高，培養(yǎng)效果更好。圖1腐敗梭菌革蘭氏染色鏡檢圖（在相同環(huán)境條件下：A：腐敗梭菌在厭氣肉肝湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)的密度；B：腐敗梭菌在自制培養(yǎng)基中培養(yǎng)密度）Figure1GramstainingmicroscopicexaminationofC.septicum(A:C.septicuminanaerobicbrothsoupbroth;B:C.septicuminhomemademedia)3.1.2不同培養(yǎng)環(huán)境的選擇以1%的含量接種本實(shí)驗(yàn)室保存的腐敗梭菌菌種，A組液體表面以覆蓋一層1cm左右厚度的無(wú)菌液體石蠟，放置于普通培養(yǎng)箱中，37℃靜置培養(yǎng)；B組放置于一定氣體比例的厭氧培養(yǎng)箱中，37℃震蕩培養(yǎng)。如圖2所示，A組在600nm處的吸光度在各時(shí)間點(diǎn)上均小于B組，且A組在培養(yǎng)24hOD600達(dá)到最高值，而B(niǎo)組在18h時(shí)達(dá)到最高值。結(jié)果表明，相比于完全隔絕空氣，一定氣體比例的培養(yǎng)環(huán)境更有利于腐敗梭菌生長(zhǎng)。圖2腐敗梭菌在不同培養(yǎng)環(huán)境中的增菌情況(A：完全隔絕空氣組；B：混合氣體組)Figure2TheproliferationofC.septicumindifferentcultureenvironments(A:completelyisolatedairgroup;B:mixedgasgroup:)3.1.3培養(yǎng)最適pH的摸索培養(yǎng)基分為四組，分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為7.0、7.4、7.8、8.2，接入等量菌種，放置于相同培養(yǎng)環(huán)境中，厭氧培養(yǎng)24h，測(cè)定4種培養(yǎng)物在600nm處的吸光度。如圖3所示，

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文23pH為7.8時(shí)，菌液在600nm處的吸光度值最大。由此可知，腐敗梭菌在此培養(yǎng)基中的最適pH為7.8。圖3腐敗梭菌在不同pH中的增菌情況Figure3ProliferationofC.septicumindifferentculureenvironments3.1.4腐敗梭菌產(chǎn)毒條件摸索將2.2.1.3中的腐敗梭菌培養(yǎng)物各取0.5mL，分別腹腔注射3只昆明小鼠，小鼠的死亡情況如下表所示。結(jié)果說(shuō)明當(dāng)培養(yǎng)基pH為7.0時(shí)，腐敗梭菌幾乎不產(chǎn)生毒素；在pH為7.8時(shí)培養(yǎng)基中毒素含量較高。表5腐敗梭菌產(chǎn)毒條件摸索Table5ExplorationoftoxicconditionsofC.septicum3.2腐敗梭菌膠體金試紙條的制備3.2.1腐敗梭菌菌體蛋白的獲取3.2.1.1腐敗梭菌菌液PCR鑒定將腐敗梭菌進(jìn)行增菌培養(yǎng)，取少量菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳鑒定，結(jié)果如下圖所示,顯示出單一的大小為527bp的目的條帶。培養(yǎng)基pH值PHoftheculturemedium7.07.47.88.2死亡分?jǐn)?shù)Deathscore0/32/33/33/3死亡時(shí)間Timeofdeath-24h6h12h


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