本文關(guān)鍵詞：羊種布魯氏菌對巨噬細胞MHC II表達和遞呈的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis,簡稱布病)是由布魯氏菌屬(Brucella)的布魯氏菌引起的一種古老的人畜共患傳染病病,該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行,嚴重危害公共衛(wèi)生安全,并造成畜牧業(yè)經(jīng)濟巨大損失。巨噬細胞是布魯氏菌感染宿主后的首要靶細胞,巨噬細胞不僅是宿主體內(nèi)重要的免疫細胞,也是一種重要的抗原遞呈細胞,在清除病原菌、分泌多種細胞因子和對抗原的識別、活化以及免疫調(diào)節(jié)中扮演著重要的角色,國內(nèi)外己經(jīng)有一些研究表明布魯氏菌感染宿主后具有明顯的免疫抑制作用,能夠抑制MHC II分子的功能,然而,其相關(guān)原因尚不明確。本文主要研究布魯氏菌侵染巨噬細胞后引起的非典型自噬對MHC II類分子的影響以及布魯氏菌誘導(dǎo)非典型自噬的可能因素,為研究布魯氏菌免疫抑制提供新的思路和方法。1.布魯氏菌16M誘導(dǎo)的非典型自噬對巨噬細胞MHC II表達和遞呈的影響。以0.25ng/m L IFN-γ處理的小鼠巨噬細胞、布魯氏菌16M侵染0.25 ng/m L IFN-γ處理的小鼠巨噬細胞為實驗組,以未處理細胞為對照組,分別作用0 h、4 h、12 h、24 h,實時熒光定量PCR檢測胞內(nèi)MHC II類分子的轉(zhuǎn)錄水平;以布魯氏菌16M侵染0.25 ng/m L IFN-γ處理過的小鼠巨噬細胞,16M侵染0.25 ng/m L IFN-γ處理的穩(wěn)定表達Atg5、Atg7的GFP-LC3小鼠巨噬細胞為實驗組,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的GFP-LC3小鼠巨噬細胞為對照組,實時熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)MHC II轉(zhuǎn)錄水平,激光共聚焦檢測細胞內(nèi)自噬小體和溶酶體的融合率,流式細胞技術(shù)檢測細胞表面MHC II類分子平均熒光強度和OMP31平均熒光強度。結(jié)果,與0.25 ng/m L IFN-γ處理組相比,布魯氏菌16M侵染0.25 ng/m L IFN-γ處理的GFP-LC3小鼠巨噬細胞,MHC II分子m RNA水平極顯著下降(p0.01);布魯氏菌侵染穩(wěn)定表達Atg5和Atg7的GFP-LC3小鼠巨噬細胞后,細胞內(nèi)MHC II類分子m RNA水平差異不顯著(p0.05),但自噬小體和溶酶體的融合率升高,細胞表面MHC II類分子表達量顯著升高(p0.01)且對OMP31遞呈能力顯著升高(p0.01)。實驗結(jié)果表明布魯氏菌16M抑制了IFN-γ誘導(dǎo)的MHC II m RNA表達水平;GFP-LC3小鼠巨噬細胞穩(wěn)定表達自噬相關(guān)蛋白Atg5和Atg7,沒有改變布魯氏菌16M對MHC II m RNA的抑制作用,但解除了布魯氏菌16M對自噬-溶酶體降解途徑的阻滯作用,并且顯著提高了細胞表面MHC II類分子的表達量和細胞遞呈能力。2.布魯氏菌16M感染巨噬細胞誘導(dǎo)非典型自噬的可能影響因素。以布魯氏菌16M侵染小鼠巨噬細胞為實驗組,未做任何處理的小鼠巨噬細胞為對照組,4 h、12 h、24 h、48h后,通過ELISA抗體雙夾心方法檢測小鼠巨噬細胞上清液中IL-6的含量;以布魯氏菌16M侵染0.25 ng/m L IFN-γ處理的GFP-LC3小鼠巨噬細胞、5 ng/m L IL-6和0.25ng/m L IFN-γ處理的GFP-LC3小鼠巨噬細胞、5 ng/m L IL-6處理的GFP-LC3小鼠巨噬細胞為實驗組,以布魯氏菌16M侵染未做任何處理的GFP-LC3小鼠巨噬細胞為對照組,作用4 h,激光共聚焦觀察自噬小體標志性蛋白LC3的熒光顆粒;0.25 ng/m L IFN-γ、5ng/m L IL-6分別作用于小鼠巨噬細胞0 min、15 min、30 min、60 min,及0.25 ng/m L IFN-γ和5 ng/m L IL-6共同作用于小鼠巨噬細胞4 h,相對熒光定量PCR檢測自噬相關(guān)蛋白Atg5和Atg7的表達量。結(jié)果布魯氏菌強毒株16M侵染小鼠巨噬細胞,IL-6細胞因子表達量相比對照組顯著升高(p0.01);且激光共聚焦檢測到IFN-γ處理過的小鼠巨噬細胞自噬特異性標簽GFP-LC3的熒光顆粒數(shù)最多,當IFN-γ的處理中同時加入IL-6時,GFP-LC3的熒光顆粒數(shù)減少;相對熒光定量PCR顯示隨時間增加,IFN-γ上調(diào)了Atg7的表達量,當作用30 min時差異顯著(P0.05),作用60 min時差異極顯著(P0.01),IFN-γ對Atg5的表達量沒有影響(P0.05),而IL-6下調(diào)了Atg7的表達量,作用15 min時差異顯著(P0.05),作用30 min時差異極顯著(P0.01),IL-6降低了Atg5的表達量,作用60 min時差異顯著(P0.05),當IL-6與IFN-γ共同作用4 h時,IL-6同樣表現(xiàn)出對Atg7、Atg5表達量的抑制作用。實驗結(jié)果表明布魯氏菌16M能促進小鼠巨噬細胞分泌IL-6,且IL-6抑制了IFN-γ誘導(dǎo)的典型自噬。以上研究結(jié)果表明布魯氏菌16M抑制了IFN-γ誘導(dǎo)的MHC II m RNA表達水平;巨噬細胞穩(wěn)定表達自噬相關(guān)蛋白Atg5、Atg7,沒有改變布魯氏菌16M對MHC II m RNA的抑制作用,但解除了布魯氏菌16M對自噬-溶酶體降解途徑的阻滯作用,并且顯著提高了細胞表面MHC II類分子的表達量和細胞遞呈能力,表明布魯氏菌通過誘導(dǎo)非典型自噬對感染的細胞產(chǎn)生免疫抑制作用;布魯氏菌16M能促進小鼠巨噬細胞分泌IL-6,且IL-6抑制IFN-γ誘導(dǎo)的典型自噬,表明布魯氏菌可能通過IL-6這一途徑干擾IFN-γ誘導(dǎo)的典型自噬從而誘發(fā)非典型自噬。
【關(guān)鍵詞】：布魯氏菌 自噬 組織相容性復(fù)合體 抗原遞呈
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 英文縮略詞表12-13
• 引言13-14
• 第一章 文獻綜述 布魯氏菌致病和免疫機制及自噬研究概述14-21
• 1.布魯氏菌致病及免疫的機制14-17
• 1.1 布魯氏菌的胞內(nèi)生存方式14-15
• 1.2 布魯氏菌在胞內(nèi)的運輸15-16
• 1.3 布魯氏菌的胞內(nèi)復(fù)制16
• 1.4 布魯氏菌與免疫16-17
• 2.病原體感染與自噬研究進展17-21
• 2.1 細胞自噬的分類17
• 2.2 免疫信號對自噬的調(diào)節(jié)17-18
• 2.3 細胞自噬清除病原體18
• 2.4 病原體逃避細胞自噬18
• 2.5 病原體利用細胞自噬18
• 2.6 布魯氏菌感染與自噬研究進展18-19
• 2.7 自噬在抗原遞呈中作用的研究進展19-21
• 第二章 實驗部分21-55
• 實驗一 羊種布魯氏菌感染小鼠巨噬細胞對MHC II表達和遞呈的影響21-46
• 摘要21-22
• 1.材料方法22-35
• 1.1 材料22
• 1.1.1 巨噬細胞和菌株22
• 1.1.2 實驗主要試劑22
• 1.1.3 實驗主要儀器和設(shè)備22
• 1.2 實驗方法22-35
• 1.2.1 細胞培養(yǎng)液DMEM和PBS緩沖液配制22
• 1.2.2 小鼠巨噬細胞的培養(yǎng)22-23
• 1.2.3 羊種布魯氏菌強毒株 16M的培養(yǎng)與鑒定23-24
• 1.2.4 實時熒光定量引物設(shè)計24
• 1.2.5 RT-qPCR檢測布魯氏菌侵染巨噬細胞胞內(nèi)MHC II轉(zhuǎn)錄水平24-26
• 1.2.6 構(gòu)建Atg5和Atg7穩(wěn)定表達載體26-31
• 1.2.7 重組慢病毒包裝31-32
• 1.2.8 慢病毒感染GFP-LC3小鼠巨噬細胞32-33
• 1.2.9 RT-qPCR檢測Atg5和Atg7轉(zhuǎn)染效果33
• 1.2.10 RT-qPCR檢測穩(wěn)定表達Atg5和Atg7巨噬細胞MHC II轉(zhuǎn)錄水平33
• 1.2.11 激光共聚焦檢測自噬小體和溶酶體融合率33-34
• 1.2.12 流式細胞技術(shù)檢測細胞表面MHC II的表達量34-35
• 1.2.13 流式細胞技術(shù)檢測細胞表面OMP31的熒光強度35
• 1.2.14 統(tǒng)計學分析35
• 2.實驗結(jié)果35-44
• 2.1 MHC II分子特異性引物和羊種布魯氏菌強毒株 16M的鑒定35-36
• 2.2 RT-qPCR檢測布魯氏菌侵染IFN-γ 處理的巨噬細胞MHC II轉(zhuǎn)錄水平36-37
• 2.3 PCR擴增Atg5、Atg7基因37-38
• 2.4 雙酶切鑒定pMD19-T-Atg5重組載體和pMD19-T-Atg7重組載體38-39
• 2.5 RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染效率39-40
• 2.6 RT-qPCR檢測布魯氏菌誘導(dǎo)的自噬對細胞內(nèi)MHC II轉(zhuǎn)錄水平的影響40
• 2.7 布魯氏菌 16M誘導(dǎo)的自噬對細胞自噬小體和溶酶體融合率影響40-41
• 2.8 布魯氏菌 16M誘導(dǎo)的自噬對細胞表面MHC II表達水平的研究41-43
• 2.9 布魯氏菌 16M誘導(dǎo)的自噬對MHC II抗原遞呈能力的影響43-44
• 3.討論44-46
• 實驗二 羊種布魯氏菌感染的巨噬細胞中IL-6 對IFN-γ 誘導(dǎo)的自噬影響46-55
• 摘要46
• 1.實驗材料與方法46-49
• 1.1 材料46-47
• 1.1.1 巨噬細胞和菌株46-47
• 1.1.2 實驗主要試劑47
• 1.1.3 實驗主要儀器和設(shè)備47
• 1.2 實驗方法47-49
• 1.2.1 ELISA雙抗夾心法檢測布魯氏菌感染的巨噬細胞中細胞因子IL-647-48
• 1.2.3 激光共聚焦檢測自噬特異性標簽GFP-LC3的熒光顆粒48-49
• 1.2.4 RT-qPCR檢測自噬相關(guān)基因Atg5與Atg7轉(zhuǎn)錄水平49
• 1.2.5 統(tǒng)計學分析49
• 2.結(jié)果49-53
• 2.1 布魯氏菌 16M侵染小鼠巨噬細胞細胞因子IL-6 表達量49-50
• 2.2 激光共聚焦檢測自噬特異性標簽GFP-LC3熒光顆粒數(shù)50
• 2.3 RT-qPCR檢測IFN-γ 和IL-6 對細胞中自噬相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄水平影響50-53
• 3.討論53-55
• 全文小結(jié)55-56
• 參考文獻56-62
• 致謝62-63
• 個人簡介63-64
• 導(dǎo)師評閱表64

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 張佩君;劉慧;李延華;趙玄多;陳德坤;;抗布魯菌感染免疫防御機制及相關(guān)保護性抗原研究進展[J];動物醫(yī)學進展;2014年02期

2 李瓊;吳淑燕;黃瑞;;自噬在細菌感染與免疫應(yīng)答中的作用[J];微生物與感染;2009年02期

3 王文玉;樊紅琨;趙國強;喬鵬;王書春;伍鋼;;Beclin1基因慢病毒表達載體的構(gòu)建和鑒定[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年33期

  本文關(guān)鍵詞：羊種布魯氏菌對巨噬細胞MHC II表達和遞呈的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：294543