發(fā)布時間：2017-04-08 06:09

  本文關(guān)鍵詞：豬輪狀病毒的分離鑒定及其環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)檢測方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：輪狀病毒(Rotavirus)作為一種重要的腸道微生物,能造成多種小動物和新生嬰幼兒腹瀉。PoRV與PEDV、TGEV并稱為引起腹瀉的三大病毒。目前,在世界上許多國家和地區(qū)均發(fā)現(xiàn)輪狀病毒可引起相關(guān)腹瀉疾病,對農(nóng)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。本實驗室自2013年到2014年,在全國不同省市和地區(qū)采集腹瀉樣品362份,進行流行病學(xué)調(diào)查,檢測結(jié)果顯示,362份樣品中,PEDV的陽性樣品數(shù)為223份,陽性率為61.6%,TGEV的陽性樣品數(shù)為2份,陽性率為0.55%;PoRV的陽性樣品數(shù)為8份,陽性率為2.2%;PKV的陽性樣品數(shù)為66份,陽性率為18.23%。將來自江蘇省某發(fā)病豬場的輪狀病毒陽性樣品處理并與20ug/mL胰酶等體積混合后接種至MA-104細胞上,盲傳8代,細胞出現(xiàn)變圓、拉網(wǎng)、脫落等病變。PCR及測序結(jié)果顯示為豬輪狀病毒,命名為JS株。三次蝕斑克隆純化后測定TCID50為10-6.875/mL,中和試驗用病毒的最佳稀釋倍數(shù)為150倍,并建立抗體檢測方法。JS分離株的VP4基因型與P[7]基因型同源性最高,VP7基因型與G[9]基因型同源性最高。根據(jù)A群輪狀病毒最新分類方法,JS分離株屬于P[7]G[9]型。采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù),建立了一種快速檢測輪狀病毒的實驗方法。結(jié)果顯示,當反應(yīng)體系中甜菜堿濃度為0.8M,鎂離子濃度為2mM,最佳反應(yīng)溫度為63℃時反應(yīng)60min,擴增可達最佳效果。且該方法特異性良好,靈敏度為RT-PCR的100倍�？捎糜诂F(xiàn)場檢測,具有良好的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：豬輪狀病毒 流行病學(xué)調(diào)查 分離 鑒定 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-12
• 中英文縮略表12-13
• 第一章 引言13-22
• 1.1 病原學(xué)13-14
• 1.2 流行病學(xué)14-15
• 1.3 臨床癥狀15
• 1.4 病理變化15-16
• 1.5 基因組學(xué)研究進展16-18
• 1.6 輪狀病毒檢測方法的研究進展18-20
• 1.6.1 免疫學(xué)方法18-19
• 1.6.2 分子生物學(xué)技術(shù)19-20
• 1.7 輪狀病毒的疫苗研究進展20-22
• 1.7.1 滅活苗20
• 1.7.2 弱毒活疫苗20
• 1.7.3 多價重配疫苗20-21
• 1.7.4 基因工程疫苗21
• 1.7.5 植物基因工程技術(shù)21-22
• 第二章 豬腹瀉病毒的流行病學(xué)調(diào)查22-30
• 摘要22
• 2.1 實驗材料22
• 2.2 物品準備22-23
• 2.3 實驗儀器及試劑23
• 2.4 實驗方法23-28
• 2.4.1 樣品采集23-24
• 2.4.2 無害化處理24
• 2.4.3 樣品保存24
• 2.4.4 樣品編號、采樣單填寫24
• 2.4.5 樣品處理24-25
• 2.4.6 腹瀉四聯(lián)引物設(shè)計25
• 2.4.7 RT-PCR檢測25-26
• 2.4.8 PCR的擴增26-27
• 2.4.9 瓊脂糖凝膠電泳27-28
• 2.5 結(jié)果與分析28-30
• 2.5.1 PCR檢測結(jié)果28
• 2.5.2 討論28-30
• 第三章 豬輪狀病毒的分離與鑒定30-47
• 摘要30
• 3.1 實驗材料30
• 3.2 實驗儀器及試劑30-31
• 3.3 病料的接種31
• 3.4 引物設(shè)計31
• 3.5 病毒RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR31-32
• 3.6 感受態(tài)的制備32
• 3.7 PMD-18T-VP4、PMD-18T-VP7陽性質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定32
• 3.8 豬輪狀病毒蝕斑克隆純化32-33
• 3.9 豬輪狀病毒TCID50的測定33-34
• 3.9.1 細胞制備33
• 3.9.2 滴定33-34
• 3.9.3 接種34
• 3.9.4 計算感染量34
• 3.10 豬輪狀病毒抗體檢測方法的建立34-35
• 3.10.1 豬輪狀病毒中和試驗用病毒的制備34-35
• 3.10.2 豬輪狀病毒抗體檢測（中和試驗）35
• 3.11 結(jié)果35-46
• 3.11.1 豬輪狀病毒分離與鑒定35-37
• 3.11.2 PMD-18T-VP4、PMD-18T-VP7重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果37-38
• 3.11.3 JS分離株VP4基因型別分析38
• 3.11.4 JS分離株VP7基因型別分析38-41
• 3.11.5 豬輪狀病毒的噬斑克隆純化41-42
• 3.11.6 TCID50測定42-43
• 3.11.7 豬輪狀病毒抗體檢測方法的建立43-46
• 3.12 討論46-47
• 第四章 豬輪狀病毒LAMP檢測方法的建立47-54
• 摘要47-48
• 4.1 材料48
• 4.1.1 試驗用毒株48
• 4.1.2 主要儀器48
• 4.1.3 主要試劑48
• 4.2 試驗方法48-50
• 4.2.1 豬輪狀病毒JS分離株RNA的提取48
• 4.2.2 病毒cDNA的制備48
• 4.2.3 LAMP引物的設(shè)計48-49
• 4.2.4 LAMP反應(yīng)體系的建立49-50
• 4.3 結(jié)果50-53
• 4.3.1 最佳甜菜堿濃度的摸索50
• 4.3.2 最佳Mg2+濃度的摸索50-51
• 4.3.3 最佳反應(yīng)溫度的摸索51
• 4.3.4 LAMP擴增產(chǎn)物的序列測定51
• 4.3.5 LAMP引物特異性檢測51-52
• 4.3.6 LAMP引物靈敏性檢測52
• 4.3.7 臨床樣本檢測52-53
• 4.4 討論53-54
• 第五章 結(jié)論54-55
• 參考文獻55-61
• 附錄61-65
• 致謝65-66
• 作者簡介66

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 高華英;孟紅;;VP7、VP4與輪狀病毒裝配及分子流行病學(xué)[J];國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志;2006年02期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 吳奇英;豬輪狀病毒TaqMan熒光定量RT-PCR方法的建立及初步應(yīng)用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：豬輪狀病毒的分離鑒定及其環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)檢測方法的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：292224